Zo kwantificeer je IHC-kleuring

Bepaal wat je meet

Kies de maat voordat je naar de resultaten kijkt, en gebruik voor elk monster dezelfde. Voor een index op basis van tellingen laat de Ki-67-index-calculator zien hoeveel een telling van een bepaalde grootte kan afwijken.

Software voor IHC-kwantificatie

Een bredere vergelijking van analysetools vind je in de vergelijking van software voor microscopiebeeldanalyse.

Zo kwantificeer je IHC in QuPath

1. Open de coupe en zet het beeldtype op Brightfield (H-DAB), zodat QuPath hematoxyline van DAB scheidt.
2. Teken een annotatie rond het weefsel dat je wilt scoren. Scoor niet het hele beeld: plooien, randen en achtergrond vertekenen het resultaat.
3. Voer Analyze › Cell detection › Positive cell detection uit op de annotatie. Controleer of de gedetecteerde kernen overeenkomen met het beeld, en pas de detectie-instellingen aan als kernen zijn samengevoegd of gemist.
4. Zet voor een nucleaire marker Score compartment op Nucleus: DAB OD mean. Eén drempel splitst cellen in positief en negatief; met maximaal drie drempels worden ze gegradeerd als zwak, matig en sterk (1+, 2+, 3+).
5. Lees Positive % voor de annotatie af op het tabblad Annotations. Met drie drempels berekent QuPath ook de H-score, van 0 tot 300.
6. Open Measure › Show annotation measurements, exporteer de tabel naar CSV voor je statistiek en noteer de drempels in je methodesectie.

Dezelfde intensiteitsdrempels kun je achteraf wijzigen met Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, zonder de cellen opnieuw te detecteren.

Zo kwantificeer je DAB-kleuring in Fiji (ImageJ)

1. Open het RGB-beeld in helderveld. Een hele coupe is meestal te groot om op volledige resolutie te openen, dus exporteer er eerst een regio of veld uit.
2. Voer Image › Color › Colour Deconvolution uit en kies de vectoren H DAB. Je krijgt drie beelden: hematoxyline, DAB en een restbeeld.
3. Voor het gekleurde oppervlak: zet op het DAB-beeld een drempel met Image › Adjust › Threshold, vink Area fraction en Limit to threshold aan onder Analyze › Set Measurements, en voer daarna Analyze › Measure uit.
4. Voor het percentage positieve cellen: tel de kernen op het hematoxyline- en het DAB-beeld (drempel, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) en deel daarna de positieve kernen door alle kernen.
5. Gebruik voor elk beeld dezelfde drempelwaarden, en neem de stappen op als macro zodat de batch reproduceerbaar is.

De auteur van de plug-in waarschuwt ertegen de donkerte van DAB te lezen als een hoeveelheid antigeen: DAB volgt de wet van Lambert-Beer niet, en immunokleuring is niet stoichiometrisch. Vergelijk intensiteit alleen binnen één kleuringsrun, en tel liever positieve cellen of meet het oppervlak dan ruwe donkerte te vergelijken.

Zo scoor je IHC in SlideScope (zonder code)

1. Open de coupe in SlideScope op Windows of Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF en de andere formaten die het leest) en teken of zoom in op de regio die je wilt scoren.
2. Open Quantify, zet Objects op kernen en Stains op Hematoxylin + DAB (IHC). Wijken de kleuren van je kleuring af van de standaardwaarden, schat dan de kleuringsvectoren uit de coupe.
3. Zet onder Marker classification de optie Classify marker-positive objects aan, met DAB als positieve marker. De drie gradatiedrempels (1+, 2+, 3+, in optische dichtheid) beginnen op 0,2; 0,4 en 0,6 en zijn aan te passen.
4. Voer het uit. Elke kern krijgt een contour op het beeld, zodat je het resultaat kunt controleren, de klasse van een kern kunt corrigeren of alles kunt uitsluiten wat verkeerd is gelezen.
5. Lees percentage positief, H-score, Allred-score en positieve cellen per mm² voor de regio af, en exporteer daarna de objecttabel (CSV), de contouren (GeoJSON, dat QuPath opent) en een samenvatting van de methode.

Of typ de vraag. Met Ask Your Slide kun je vragen: ‘Welk percentage van de kernen is Ki67-positief in deze regio?’ of ‘Geef me de H-score en de Allred-score voor het gebied dat ik heb omlijnd’, en SlideScope voert dezelfde tools uit op je computer en toont het bewijs voor elk getal. De scores gebruiken dezelfde definities als QuPath, zodat beide op dezelfde cellen overeenkomen. De scoring gradeert kernen en past dus bij nucleaire markers; de resultaten zijn bedoeld voor onderzoek en vragen om je eigen visuele controle. Meer op de pagina over tellen.

Wat bepaalt of het getal klopt

• Waar de marker zit: scoring op basis van kernen past bij nucleaire markers zoals Ki-67, ER, PR en p53. Bij membraanmarkers (HER2, PD-L1) en cytoplasmatische markers moet de kleuring in dat compartiment worden gemeten, en de klinische scoring ervan volgt de handleiding van de assay zelf.
• Drempels ingesteld op controles: leg de positiviteitsdrempel vast op controleweefsel uit dezelfde kleuringsrun voordat je het experiment scoort, en pas hem nooit per coupe aan.
• De regio: scoor het weefsel waar de vraag over gaat, en laat necrose, plooien, randkleuring en stroma weg, tenzij het protocol ze meeneemt. Hotspots en hele coupes geven verschillende getallen; vermeld welke je hebt gebruikt.
• Controleer de detectie: bekijk de contouren. Samengevoegde kernen verlagen de telling en gesplitste kernen verhogen haar; dicht weefsel vraagt om een deep-learningdetector of aangepaste instellingen.
• Genoeg cellen, de juiste n: scoor enkele honderden cellen per monster, en doe de statistiek op één waarde per dier of patiënt, niet op cellen of velden.
• Rapporteer het: software en versie, kleuringsvectoren, drempels, de regel voor de regio, getelde cellen en wie het resultaat heeft gecontroleerd.

Vragen

Bronnen

• QuPath-documentatie: celdetectie, Positive cell detection en Score compartment
• QuPath-documentatie: celclassificatie, intensiteitsdrempels, Positive % en H-score
• ImageJ-documentatie: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: de vectoren H DAB, en waarom de donkerte van DAB geen maat is voor antigeen
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Deze gids is bedoeld voor onderzoek en onderwijs. Het is geen diagnostische procedure: scoring voor patiëntenzorg volgt de gevalideerde assay, de huidige richtlijn voor die marker en het oordeel van een patholoog.