IHC nicelleştirme

IHC Boyaması Nasıl Nicelenir?

Kahverengi bir immünohistokimya boyamasını sayıya dönüştürmek dört karar gerektirir: neyin ölçüleceği, slaytın neresinde ölçüleceği, bir hücrenin ne zaman pozitif sayılacağı ve neyin raporlanacağı. Bu kılavuz önce bu kararları ele alır, ardından QuPath’teki, Fiji’deki (ImageJ) ve kod gerektirmeden SlideScope’taki adımları verir.

SlideScope’u indirinQuPath’teki adımlar

Neyi ölçeceğinize karar verin

ÖlçütNedirNe zaman kullanılır
Pozitif hücre yüzdesiPozitif hücreler ÷ sayılan tüm hücreler × 100 (bir işaretlenme indeksi)Soru, belirteci kaç hücrenin eksprese ettiği olduğunda: Ki-67, ER, PR, p53 ve çoğu nükleer belirteç
H-score (0-300)1 × % zayıf + 2 × % orta + 3 × % güçlüBoyanma şiddeti hücreden hücreye değiştiğinde ve sorunuz için önemli olduğunda
Allred skoru (0-8)Oran skoru (0-5) + ortalama yoğunluk skoru (0-3)Bunu raporlayan bir protokolü izlediğinizde; klasik olarak meme dokusunda ER ve PR
Boyanan alan oranıDAB pozitif alan ÷ doku alanı × 100Boya sayılabilir hücrelerle sınırlı olmadığında: hücre dışı matriks, plaklar, lifler, diffüz boyanma
mm² başına pozitif hücrePozitif hücreler ÷ analiz edilen doku alanıİnfiltre eden veya dağınık hücreleri, örneğin bağışıklık hücrelerini, bölgeler arasında karşılaştırırken

Ölçütü sonuçlara bakmadan önce seçin ve her örnek için aynısını kullanın. Sayıma dayalı bir indeks için Ki-67 indeksi hesaplayıcı, belirli büyüklükteki bir sayımın ne kadar sapabileceğini gösterir.

IHC nicelleştirme yazılımları

AraçÜcretPlatformlarIHC için ne yapar
QuPathÜcretsiz, açık kaynakWindows, macOS, LinuxTam slaytlarda hücre algılama; tek eşikle Positive %, üç eşikle H-score; toplu işlem için betikler
Fiji / ImageJÜcretsiz, açık kaynakWindows, macOS, LinuxColour Deconvolution boyaları ayırır; eşikleme, alan oranı ve parçacık sayımı elle yapılan adımlar veya bir makrodur
SlideScopeÜcretli; kendi görüntülerinizi skorlamak için abonelik gerekirWindows 10/11, macOS 14+Bir bölgenin kodsuz skorlanması: nükleer DAB belirteçleri için pozitif yüzdesi, H-score ve Allred skoru; ya da gündelik dilde sorarak
HALO, VisiopharmTicari, lisans teklif usulüyleWindowsYüksek hacimli ve düzenlemeye tabi laboratuvarlara yönelik IHC analiz modülleri

Analiz araçlarının daha geniş bir karşılaştırması mikroskopi görüntü analizi yazılımlarının karşılaştırması sayfasında.

QuPath’te IHC nasıl nicelenir?

  1. Slaytı açın ve görüntü türünü Brightfield (H-DAB) olarak ayarlayın; böylece QuPath hematoksileni DAB’dan ayırır.
  2. Skorlanacak dokunun çevresine bir açıklama (annotation) çizin. Görüntünün tamamını skorlamaktan kaçının: kıvrımlar, kenarlar ve arka plan sonucu çarpıtır.
  3. Açıklama üzerinde Analyze › Cell detection › Positive cell detection’ı çalıştırın. Algılanan çekirdeklerin görüntüyle örtüştüğünü kontrol edin; çekirdekler birleşmiş veya atlanmışsa algılama ayarlarını düzenleyin.
  4. Nükleer bir belirteç için Score compartment’ı Nucleus: DAB OD mean olarak ayarlayın. Tek bir eşik hücreleri pozitif ve negatif olarak ayırır; en fazla üç eşik onları zayıf, orta ve güçlü (1+, 2+, 3+) olarak derecelendirir.
  5. Açıklamanın Positive % değerini Annotations sekmesinde okuyun. Üç eşikle QuPath 0 ile 300 arasındaki H-score’u da hesaplar.
  6. Measure › Show annotation measurements’ı açın, tabloyu istatistikleriniz için CSV olarak dışa aktarın ve eşikleri yöntemler bölümünüze not edin.

Aynı yoğunluk eşikleri, hücreleri yeniden algılamadan Classify › Object classification › Set cell intensity classifications ile sonradan değiştirilebilir.

Fiji’de (ImageJ) DAB boyaması nasıl nicelenir?

  1. Parlak alan RGB görüntüsünü açın. Tam bir slayt genellikle tam çözünürlükte açılamayacak kadar büyüktür; bu yüzden önce ondan bir bölge veya alan dışa aktarın.
  2. Image › Color › Colour Deconvolution’ı çalıştırın ve H DAB vektörlerini seçin. Üç görüntü elde edersiniz: hematoksilen, DAB ve bir artık görüntü.
  3. Boyanan alan için: DAB görüntüsünde Image › Adjust › Threshold ile bir eşik belirleyin, Analyze › Set Measurements altında Area fraction ve Limit to threshold seçeneklerini işaretleyin, ardından Analyze › Measure’ı çalıştırın.
  4. Pozitif hücre yüzdesi için: çekirdekleri hematoksilen ve DAB görüntülerinde sayın (eşik, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), ardından pozitif çekirdekleri tüm çekirdeklere bölün.
  5. Her görüntü için aynı eşik değerlerini kullanın ve toplu işlemin tekrarlanabilir olması için adımları bir makro olarak kaydedin.

Eklentinin yazarı DAB koyuluğunu antijen miktarı olarak okumaya karşı uyarır: DAB, Beer-Lambert yasasına uymaz ve immün boyama stokiyometrik değildir. Yoğunluğu yalnızca tek bir boyama turu içinde karşılaştırın; ham koyuluğu karşılaştırmak yerine pozitif hücre saymayı veya alan ölçmeyi tercih edin.

SlideScope’ta IHC nasıl skorlanır? (kodsuz)

  1. Slaytı Windows’ta veya Mac’te SlideScope ile açın (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF ve okuyabildiği diğer biçimler) ve skorlanacak bölgeyi çizin ya da o bölgeye yakınlaştırın.
  2. Quantify’ı açın, Objects’i çekirdekler, Stains’i Hematoxylin + DAB (IHC) olarak ayarlayın. Boyanızın renkleri varsayılanlardan farklıysa boya vektörlerini slayttan tahmin edin.
  3. Marker classification altında, pozitif belirteç olarak DAB ile Classify marker-positive objects’i açın. Üç derece eşiği (1+, 2+, 3+; optik yoğunluk cinsinden) 0,2; 0,4 ve 0,6 değerleriyle başlar ve düzenlenebilir.
  4. Çalıştırın. Her çekirdeğin dış hattı görüntü üzerinde çizilir; böylece sonucu kontrol edebilir, bir çekirdeğin sınıfını düzeltebilir veya yanlış okunan her şeyi dışarıda bırakabilirsiniz.
  5. Bölge için pozitif yüzdesini, H-score’u, Allred skorunu ve mm² başına pozitif hücre sayısını okuyun; ardından nesne tablosunu (CSV), dış hatları (QuPath’in açtığı GeoJSON) ve bir yöntem özetini dışa aktarın.

Ya da sorunuzu yazın. Ask Your Slide ile “Bu bölgedeki çekirdeklerin yüzde kaçı Ki67 pozitif?” ya da “Çizdiğim alan için H-score ve Allred skorunu ver” diye sorabilirsiniz; SlideScope aynı araçları bilgisayarınızda çalıştırır ve her sayının kanıtını gösterir. Skorlar QuPath ile aynı tanımları kullanır; bu yüzden ikisi aynı hücrelerde aynı sonucu verir. Skorlama çekirdekleri derecelendirir, bu da nükleer belirteçlere uygundur; sonuçlar araştırma amaçlıdır ve sizin görsel kontrolünüzü gerektirir. Ayrıntılar sayım sayfasında.

Sayının doğru olup olmadığını ne belirler?

  • Belirtecin yeri: çekirdek tabanlı skorlama Ki-67, ER, PR ve p53 gibi nükleer belirteçlere uygundur. Membranöz (HER2, PD-L1) ve sitoplazmik belirteçlerde boyanmanın o kompartmanda ölçülmesi gerekir; bunların klinik skorlaması da testin kendi kılavuzunu izler.
  • Eşikler kontroller üzerinde belirlenir: pozitiflik eşiğini, deneyi skorlamadan önce aynı boyama turundaki kontrol dokusunda sabitleyin ve asla slayta göre ayarlamayın.
  • Bölge: sorunun ilgili olduğu dokuyu skorlayın; protokol dahil etmedikçe nekrozu, kıvrımları, kenar boyanmasını ve stromayı dışarıda bırakın. Sıcak noktalar ve tüm kesitler farklı sayılar verir; hangisini kullandığınızı belirtin.
  • Algılamayı kontrol edin: dış hatlara bakın. Birleşmiş çekirdekler sayımı düşürür, bölünmüş çekirdekler yükseltir; kalabalık doku için derin öğrenme tabanlı bir algılayıcı veya ayarlanmış parametreler gerekir.
  • Yeterli hücre, doğru n: örnek başına birkaç yüz hücre skorlayın ve istatistikleri hücreler veya alanlar üzerinden değil, hayvan veya hasta başına tek bir değer üzerinden yapın.
  • Raporlayın: yazılım ve sürümü, boya vektörleri, eşikler, bölge seçim kuralı, sayılan hücreler ve sonucu kimin kontrol ettiği.

Sorular

IHC boyaması nasıl nicelenir?

Neyi ölçeceğinize karar verin (pozitif hücre yüzdesi, H-score, Allred skoru veya boyanan alan), skorlanacak bölgenin dış hattını çizin, DAB boyasını renk dekonvolüsyonuyla hematoksilenden ayırın, hücreleri algılayın, her birini sabit eşiklere göre derecelendirin ve skoru eşiklerle ve hücre sayısıyla birlikte raporlayın.

IHC nicelleştirmesi için hangi yazılım kullanılır?

QuPath ve Fiji (ImageJ) ücretsizdir ve yaygın olarak kullanılır. QuPath tam slaytlarda hücreleri algılar ve pozitif yüzdesini ve H-score’u bildirir; Fiji boyaları ayırır ve sayım adımlarını size bırakır. SlideScope bir bölgeyi kod yazmadan skorlar; HALO ve Visiopharm gibi ticari platformlar ise IHC modülleri satar.

Pozitif yüzdesi mi, H-score mu daha iyidir?

Pozitif yüzdesi, belirteci kaç hücrenin eksprese ettiği sorusunu yanıtlar ve yeniden üretilmesi daha kolay sayıdır. H-score ayrıca hücrelerin ne kadar güçlü boyandığını da ağırlıklandırır; bu, yoğunluk değiştiğinde işe yarar, ancak üç eşiğe bağlıdır. Her iki durumda da pozitif yüzdesini raporlayın.

ImageJ DAB yoğunluğunu ölçebilir mi?

Ayrılmış DAB görüntüsünün ne kadar koyu olduğunu ölçebilir; ancak DAB Beer-Lambert yasasına uymaz ve immün boyama stokiyometrik değildir, bu nedenle koyuluk antijen miktarının bir ölçüsü değildir. Pozitif hücreleri saymak ya da boyanan alanı ölçmek, ham koyuluğu karşılaştırmaktan daha savunulabilirdir.

Kaç alan veya hücre skorlamalıyım?

Dokuyu temsil edecek kadar: örnek başına en az birkaç yüz hücre, boyanmaya bakmadan önce belirlenmiş bir kurala göre seçilmiş alanlardan. İstatistik birimi hücre değil, hayvan veya hastadır.

SlideScope IHC niceler mi?

Evet, nükleer DAB belirteçleri için. Seçtiğiniz bölgedeki çekirdekleri sayar, her birini ortalama DAB optik yoğunluğuna göre derecelendirir ve pozitif yüzdesini, H-score’u ve Allred skorunu kendi bilgisayarınızda bildirir. Ücretsiz bir örnek kitaplığı (tüm araçlarla) ve kendi görüntüleriniz için abonelik sunan ücretli bir uygulamadır. Yalnızca araştırma amaçlıdır.

Kaynaklar

Bu kılavuz araştırma ve eğitim içindir. Bir tanı prosedürü değildir: hasta bakımına yönelik skorlama, valide edilmiş testi, o belirteç için güncel kılavuzu ve bir patoloğun değerlendirmesini izler.

IHC’yi kendi slaytlarınızda skorlayın

SlideScope slaytınızın bir bölgesini kendi bilgisayarınızda skorlar ve her sayının arkasındaki dış hatları gösterir. Tüm araçları yerleşik örneklerde ücretsiz deneyin; kendi görüntülerinizi açmak için abonelik gerekir. Kararınızı verdiniz mi? Hemen abone olun.

SlideScope’u indirin