IHC 染色を定量する方法

何を測るかを決める

結果を見る前に指標を選び、すべてのサンプルで同じものを使ってください。計数に基づく指数なら、Ki-67 指数計算ツールで、ある数の計数がどれだけずれうるかを確認できます。

IHC 定量のためのソフトウェア

解析ツールのより幅広い比較は、顕微鏡画像解析ソフトウェアの比較をご覧ください。

QuPath で IHC を定量する方法

1. スライドを開き、画像タイプを Brightfield (H-DAB) に設定して、QuPath がヘマトキシリンと DAB を分離できるようにします。
2. スコアリングする組織をアノテーションで囲みます。画像全体をスコアリングするのは避けてください。ひだ、辺縁、背景が結果をゆがめます。
3. アノテーションに対して Analyze › Cell detection › Positive cell detection を実行します。検出された核が画像と一致しているかを確認し、核が結合していたり見落とされていたりする場合は検出設定を調整します。
4. 核マーカーの場合は Score compartment を Nucleus: DAB OD mean に設定します。しきい値を 1 つにすると細胞は陽性と陰性に分かれ、最大 3 つにすると弱陽性、中等度陽性、強陽性（1+、2+、3+）にグレード分けされます。
5. Annotations タブで、アノテーションの Positive % を読み取ります。しきい値を 3 つ設定すると、QuPath は 0～300 の H-score も計算します。
6. Measure › Show annotation measurements を開き、統計解析用に表を CSV にエクスポートして、しきい値を手法の項に記録します。

同じ強度しきい値は、細胞を検出し直さなくても、後から Classify › Object classification › Set cell intensity classifications で変更できます。

Fiji（ImageJ）で DAB 染色を定量する方法

1. 明視野の RGB 画像を開きます。全スライド画像はたいてい大きすぎてフル解像度では開けないため、先に領域や視野をエクスポートしておきます。
2. Image › Color › Colour Deconvolution を実行し、H DAB ベクトルを選びます。ヘマトキシリン、DAB、残差の 3 つの画像が得られます。
3. 染色面積を求める場合：DAB 画像で Image › Adjust › Threshold によりしきい値を設定し、Analyze › Set Measurements で Area fraction と Limit to threshold にチェックを入れてから、Analyze › Measure を実行します。
4. 陽性細胞率を求める場合：ヘマトキシリン画像と DAB 画像で核を数え（しきい値の設定、Process › Binary › Watershed、Analyze › Analyze Particles）、陽性核の数をすべての核の数で割ります。
5. すべての画像で同じしきい値を使い、手順をマクロとして記録して、バッチ処理を再現できるようにします。

このプラグインの作者は、DAB の濃さを抗原量として読み取らないよう注意を促しています。DAB は Beer-Lambert の法則に従わず、免疫染色は化学量論的ではありません。染色強度の比較は 1 回の染色ランの中だけにとどめ、生の濃さを比べるよりも、陽性細胞を数えるか面積を測る方法を選んでください。

SlideScope で IHC をスコアリングする方法（コード不要）

1. Windows または Mac の SlideScope でスライドを開き（SVS、NDPI、MRXS、CZI、TIFF をはじめとする対応形式）、スコアリングする領域を描くか、その領域までズームします。
2. Quantify を開き、Objects を核（nuclei）に、Stains を Hematoxylin + DAB (IHC) に設定します。染色の色がデフォルトと異なる場合は、スライドから染色ベクトルを推定します。
3. Marker classification で、DAB を陽性マーカーとして Classify marker-positive objects をオンにします。3 つのグレードのしきい値（1+、2+、3+、光学濃度）は 0.2、0.4、0.6 から始まり、編集できます。
4. 実行します。各核が画像上に輪郭表示されるので、結果を確認し、核のクラスを修正したり、誤って読み取られたものを除外したりできます。
5. 領域の陽性細胞率、H-score、Allred スコア、mm² あたりの陽性細胞数を読み取り、オブジェクト表（CSV）、輪郭（QuPath で開ける GeoJSON）、手法の概要をエクスポートします。

質問を入力する方法もあります。Ask Your Slide なら、“この領域で Ki67 陽性の核は何パーセント？”や“囲んだ領域の H-score と Allred スコアを出して”のように質問でき、SlideScope がこれらと同じツールをお使いのコンピューター上で実行し、すべての数値の根拠を示します。スコアは QuPath と同じ定義を使うため、同じ細胞なら両者の結果は一致します。スコアリングは核をグレード分けするものなので、核マーカーに適しています。結果は研究用途に限られ、目視での確認が必要です。詳しくは計数のページをご覧ください。

数値が正しいかどうかを左右するもの

• マーカーの局在：核を基準にしたスコアリングは、Ki-67、ER、PR、p53 などの核マーカーに適しています。膜マーカー（HER2、PD-L1）や細胞質マーカーでは、その区画で染色を測定する必要があり、それらの臨床的なスコアリングはアッセイ自体のマニュアルに従います。
• しきい値はコントロールで設定：陽性のしきい値は、実験をスコアリングする前に、同じ染色ランのコントロール組織で固定し、スライドごとに調整しないでください。
• 領域：問いの対象となる組織をスコアリングし、プロトコルで含めると定めていない限り、壊死、ひだ、辺縁の染色、間質は除外します。ホットスポットと切片全体では異なる数値になるため、どちらを使ったかを明記してください。
• 検出を確認：輪郭を見てください。核が結合すると計数は減り、核が分割されると計数は増えます。細胞が密集した組織には、ディープラーニングの検出器か、調整した設定が必要です。
• 十分な細胞数と正しい n：サンプルあたり数百個の細胞をスコアリングし、統計解析は細胞や視野ではなく、動物または患者 1 例につき 1 つの値で行います。
• 報告する：ソフトウェアとバージョン、染色ベクトル、しきい値、領域の選び方、数えた細胞数、結果を確認した人。

質問

出典

• QuPath ドキュメント — 細胞検出、Positive cell detection、Score compartment
• QuPath ドキュメント — 細胞分類、強度しきい値、Positive %、H-score
• ImageJ ドキュメント — Colour Deconvolution（Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299）
• Landini G. Colour Deconvolution 2 — H DAB ベクトルと、DAB の濃さが抗原量の指標にならない理由
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

このガイドは研究と教育のためのものです。診断手順ではありません。診療のためのスコアリングは、妥当性が確認されたアッセイ、そのマーカーの最新のガイドライン、そして病理医の判断に従ってください。