วิธีวัดปริมาณการย้อม IHC

ตัดสินใจว่าจะวัดอะไร

เลือกค่าที่จะวัดก่อนดูผลลัพธ์ และใช้ค่าเดียวกันกับทุกตัวอย่าง สำหรับดัชนีที่อิงการนับ เครื่องคำนวณดัชนี Ki-67 แสดงว่าการนับในจำนวนหนึ่ง ๆ อาจคลาดเคลื่อนได้เท่าใด

ซอฟต์แวร์สำหรับการวัดปริมาณ IHC

การเปรียบเทียบเครื่องมือวิเคราะห์ที่กว้างกว่านี้อยู่ในการเปรียบเทียบซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพจากกล้องจุลทรรศน์

วิธีวัดปริมาณ IHC ใน QuPath

1. เปิดสไลด์และตั้งชนิดภาพเป็น Brightfield (H-DAB) เพื่อให้ QuPath แยกฮีมาทอกซิลินออกจาก DAB
2. วาด annotation รอบเนื้อเยื่อที่จะให้คะแนน หลีกเลี่ยงการให้คะแนนทั้งภาพ เพราะรอยพับ ขอบ และพื้นหลังทำให้ผลเบี่ยงเบน
3. รัน Analyze › Cell detection › Positive cell detection บน annotation ตรวจสอบว่านิวเคลียสที่ตรวจพบตรงกับภาพ และปรับการตั้งค่าการตรวจหาหากนิวเคลียสติดกันหรือตกหล่น
4. สำหรับมาร์กเกอร์ในนิวเคลียส ให้ตั้ง Score compartment เป็น Nucleus: DAB OD mean ค่า threshold ค่าเดียวแบ่งเซลล์เป็นผลบวกและผลลบ ส่วน threshold สูงสุดสามค่าจะให้เกรดอ่อน ปานกลาง และเข้ม (1+, 2+, 3+)
5. อ่านค่า Positive % ของ annotation ในแท็บ Annotations เมื่อมี threshold สามค่า QuPath จะคำนวณ H-score ตั้งแต่ 0 ถึง 300 ให้ด้วย
6. เปิด Measure › Show annotation measurements ส่งออกตารางเป็น CSV สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติ และบันทึกค่า threshold ไว้ในส่วนวิธีการ

ค่า threshold ความเข้มชุดเดียวกันนี้เปลี่ยนภายหลังได้ด้วย Classify › Object classification › Set cell intensity classifications โดยไม่ต้องตรวจหาเซลล์ใหม่

วิธีวัดปริมาณการย้อม DAB ใน Fiji (ImageJ)

1. เปิดภาพ RGB แบบ brightfield ภาพสไลด์ทั้งแผ่นมักใหญ่เกินกว่าจะเปิดที่ความละเอียดเต็ม จึงควรส่งออกบริเวณหรือขอบเขตภาพบางส่วนออกมาก่อน
2. รัน Image › Color › Colour Deconvolution และเลือกเวกเตอร์ H DAB คุณจะได้ภาพสามภาพ: ฮีมาทอกซิลิน, DAB และภาพส่วนที่เหลือ (residual)
3. สำหรับพื้นที่ที่ติดสี: บนภาพ DAB ให้ตั้ง threshold ด้วย Image › Adjust › Threshold ติ๊ก Area fraction และ Limit to threshold ใน Analyze › Set Measurements แล้วรัน Analyze › Measure
4. สำหรับเปอร์เซ็นต์เซลล์ที่ให้ผลบวก: นับนิวเคลียสบนภาพฮีมาทอกซิลินและภาพ DAB (threshold, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) แล้วหารนิวเคลียสที่ให้ผลบวกด้วยนิวเคลียสทั้งหมด
5. ใช้ค่า threshold เดียวกันกับทุกภาพ และบันทึกขั้นตอนเป็นมาโครเพื่อให้ทำซ้ำกับทั้งชุดได้

ผู้พัฒนาปลั๊กอินเตือนว่าไม่ควรอ่านความเข้มของสี DAB เป็นปริมาณแอนติเจน เพราะ DAB ไม่เป็นไปตามกฎของ Beer-Lambert และการย้อมทางอิมมูโนไม่เป็นไปตามสัดส่วนปริมาณสัมพันธ์ (stoichiometric) ให้เปรียบเทียบความเข้มเฉพาะภายในการย้อมรอบเดียวกัน และควรนับเซลล์ที่ให้ผลบวกหรือวัดพื้นที่มากกว่าเปรียบเทียบความเข้มดิบ

วิธีให้คะแนน IHC ใน SlideScope (ไม่ต้องเขียนโค้ด)

1. เปิดสไลด์ใน SlideScope บน Windows หรือ Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF และรูปแบบอื่น ๆ ที่โปรแกรมอ่านได้) แล้ววาดหรือซูมไปยังบริเวณที่จะให้คะแนน
2. เปิด Quantify ตั้ง Objects เป็นนิวเคลียส (nuclei) และตั้ง Stains เป็น Hematoxylin + DAB (IHC) หากสีย้อมของคุณต่างจากค่าเริ่มต้น ให้ประมาณเวกเตอร์สีย้อมจากสไลด์
3. ใน Marker classification ให้เปิด Classify marker-positive objects โดยใช้ DAB เป็นมาร์กเกอร์ผลบวก ค่า threshold ของเกรดทั้งสาม (1+, 2+, 3+ ในหน่วยความหนาแน่นเชิงแสง) เริ่มต้นที่ 0.2, 0.4 และ 0.6 และแก้ไขได้
4. รันการวิเคราะห์ นิวเคลียสแต่ละตัวจะมีเส้นขอบบนภาพ คุณจึงตรวจสอบผล แก้ไขคลาสของนิวเคลียส หรือตัดสิ่งที่อ่านผิดออกได้
5. อ่านค่าเปอร์เซ็นต์ที่ให้ผลบวก, H-score, คะแนน Allred และจำนวนเซลล์ที่ให้ผลบวกต่อ mm² ของบริเวณนั้น แล้วส่งออกตารางวัตถุ (CSV) เส้นขอบ (GeoJSON ซึ่งเปิดใน QuPath ได้) และสรุปวิธีการ

หรือพิมพ์คำถาม ด้วย Ask Your Slide คุณถามได้ว่า “ในบริเวณนี้ นิวเคลียสที่เป็น Ki67 บวกมีกี่เปอร์เซ็นต์?” หรือ “ขอ H-score และคะแนน Allred ของพื้นที่ที่ฉันวาดเส้นขอบไว้” แล้ว SlideScope จะรันเครื่องมือชุดเดียวกันนี้บนคอมพิวเตอร์ของคุณและแสดงหลักฐานของทุกตัวเลข คะแนนใช้นิยามเดียวกับ QuPath ทั้งสองจึงให้ผลตรงกันกับเซลล์ชุดเดียวกัน การให้คะแนนเป็นการให้เกรดนิวเคลียส จึงเหมาะกับมาร์กเกอร์ในนิวเคลียส ผลลัพธ์มีไว้เพื่อการวิจัยและต้องให้คุณตรวจสอบด้วยตา ดูเพิ่มเติมที่หน้าการนับ

สิ่งที่กำหนดว่าตัวเลขถูกต้องหรือไม่

• ตำแหน่งของมาร์กเกอร์: การให้คะแนนที่อิงนิวเคลียสเหมาะกับมาร์กเกอร์ในนิวเคลียส เช่น Ki-67, ER, PR และ p53 มาร์กเกอร์ที่เยื่อหุ้มเซลล์ (HER2, PD-L1) และในไซโทพลาซึมต้องวัดสีย้อมในส่วนนั้นของเซลล์ และการให้คะแนนทางคลินิกต้องเป็นไปตามคู่มือของวิธีทดสอบนั้น ๆ
• ตั้งค่า threshold จากตัวควบคุม: กำหนดค่า threshold ผลบวกจากเนื้อเยื่อควบคุมในการย้อมรอบเดียวกัน ก่อนให้คะแนนการทดลอง และอย่าปรับค่าแยกตามสไลด์
• บริเวณ: ให้คะแนนเนื้อเยื่อที่ตรงกับคำถาม และตัดเนื้อตาย รอยพับ การติดสีที่ขอบ และสโตรมาออก เว้นแต่โปรโตคอลจะรวมไว้ Hot spot กับทั้งชิ้นเนื้อให้ตัวเลขต่างกัน ให้ระบุว่าใช้แบบใด
• ตรวจสอบการตรวจหา: ดูเส้นขอบ นิวเคลียสที่ติดกันทำให้จำนวนนับลดลง และนิวเคลียสที่ถูกแบ่งทำให้จำนวนนับเพิ่มขึ้น เนื้อเยื่อที่หนาแน่นต้องใช้ตัวตรวจหาแบบการเรียนรู้เชิงลึกหรือปรับการตั้งค่า
• เซลล์มากพอ และ n ที่ถูกต้อง: ให้คะแนนหลายร้อยเซลล์ต่อตัวอย่าง และทำสถิติกับค่าเดียวต่อสัตว์หรือผู้ป่วยหนึ่งราย ไม่ใช่กับเซลล์หรือขอบเขตภาพ
• รายงานให้ครบ: ซอฟต์แวร์และเวอร์ชัน เวกเตอร์สีย้อม ค่า threshold กฎการเลือกบริเวณ จำนวนเซลล์ที่นับ และผู้ที่ตรวจสอบผล

คำถาม

แหล่งอ้างอิง

• เอกสาร QuPath: การตรวจหาเซลล์ Positive cell detection และ Score compartment
• เอกสาร QuPath: การจำแนกเซลล์ ค่า threshold ความเข้ม Positive % และ H-score
• เอกสาร ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: เวกเตอร์ H DAB และเหตุใดความเข้มของ DAB จึงไม่ใช่ตัววัดแอนติเจน
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

คู่มือนี้มีไว้เพื่อการวิจัยและการเรียนการสอน ไม่ใช่ขั้นตอนการวินิจฉัย การให้คะแนนเพื่อการดูแลผู้ป่วยต้องเป็นไปตามวิธีทดสอบที่ผ่านการตรวจสอบความถูกต้อง (validated) แนวทางปัจจุบันสำหรับมาร์กเกอร์นั้น และวิจารณญาณของพยาธิแพทย์