如何定量 IHC 染色

确定测量什么

在查看结果之前选定测量指标，并对每个样本使用同一指标。对于基于计数的指数，Ki-67 指数计算器可以显示一定数量的计数可能偏差多少。

IHC 定量软件

更全面的分析工具对比见显微镜图像分析软件对比。

如何在 QuPath 中定量 IHC

1. 打开切片，将图像类型设为 Brightfield (H-DAB)，使 QuPath 把苏木精与 DAB 分开。
2. 在要评分的组织周围绘制注释。避免对整幅图像评分：褶皱、边缘和背景会使结果产生偏差。
3. 在该注释上运行 Analyze › Cell detection › Positive cell detection。检查检测到的细胞核是否与图像相符；如果细胞核被合并或漏检，请调整检测设置。
4. 对于细胞核标记物，将 Score compartment 设为 Nucleus: DAB OD mean。单个阈值把细胞分为阳性和阴性；最多三个阈值可将其分为弱、中等和强（1+、2+、3+）。
5. 在 Annotations 标签页中读取该注释的 Positive %。使用三个阈值时，QuPath 还会计算 0 到 300 的 H-score。
6. 打开 Measure › Show annotation measurements，将表格导出为 CSV 用于统计，并在方法部分记录阈值。

之后可以通过 Classify › Object classification › Set cell intensity classifications 修改这些强度阈值，无需重新检测细胞。

如何在 Fiji（ImageJ）中定量 DAB 染色

1. 打开明场 RGB 图像。全切片通常太大，无法以全分辨率打开，因此请先从中导出一个区域或视野。
2. 运行 Image › Color › Colour Deconvolution，并选择 H DAB 向量。您会得到三幅图像：苏木精、DAB 和残差。
3. 测量染色面积：在 DAB 图像上用 Image › Adjust › Threshold 设定阈值，在 Analyze › Set Measurements 中勾选 Area fraction 和 Limit to threshold，然后运行 Analyze › Measure。
4. 测量阳性细胞百分比：在苏木精图像和 DAB 图像上计数细胞核（阈值分割、Process › Binary › Watershed、Analyze › Analyze Particles），然后用阳性细胞核数除以全部细胞核数。
5. 对每幅图像使用相同的阈值，并把步骤录制为宏，使批量处理可重复。

该插件的作者提醒，不要把 DAB 的深浅解读为抗原的量：DAB 不遵循 Beer-Lambert 定律，免疫染色也不符合化学计量关系。只在同一批次染色内比较强度，并优先计数阳性细胞或测量面积，而不是比较原始的深浅程度。

如何在 SlideScope 中进行 IHC 评分（无需代码）

1. 在 Windows 或 Mac 上用 SlideScope 打开切片（SVS、NDPI、MRXS、CZI、TIFF 以及它支持的其他格式），然后绘制或缩放到要评分的区域。
2. 打开 Quantify，将 Objects 设为细胞核，将 Stains 设为 Hematoxylin + DAB (IHC)。如果您的染色颜色与默认值不同，请根据切片估计染色向量。
3. 在 Marker classification 下，打开 Classify marker-positive objects，并以 DAB 作为阳性标记物。三个分级阈值（1+、2+、3+，以光密度表示）初始为 0.2、0.4 和 0.6，可以修改。
4. 运行。每个细胞核都会在图像上勾勒出轮廓，因此您可以检查结果、更正某个细胞核的分类，或排除任何误判的对象。
5. 读取该区域的阳性百分比、H-score、Allred 评分和每 mm² 阳性细胞数，然后导出对象表（CSV）、轮廓（GeoJSON，可在 QuPath 中打开）和方法摘要。

也可以直接输入问题。使用 Ask Your Slide，您可以问“这个区域中 Ki67 阳性的细胞核占百分之多少？”或“给出我圈出区域的 H-score 和 Allred 评分”，SlideScope 会在您的电脑上运行这些相同的工具，并为每个数字展示依据。评分采用与 QuPath 相同的定义，因此两者在相同细胞上的结果一致。评分以细胞核为对象分级，适合细胞核标记物；结果仅供科研使用，并需要您目视核查。详见计数页面。

决定数字是否正确的因素

• 标记物所在的位置：基于细胞核的评分适合 Ki-67、ER、PR 和 p53 等细胞核标记物。细胞膜标记物（HER2、PD-L1）和细胞质标记物需要在相应区室中测量染色，其临床评分遵循该检测自身的说明书。
• 在对照上设定阈值：在对实验样本评分之前，用同一染色批次的对照组织确定阳性阈值，并且绝不按切片逐张调整。
• 区域：对与研究问题相关的组织评分；除非方案包含，否则排除坏死、褶皱、边缘染色和间质。热点区和整张切片会得到不同的数字；请注明您采用的是哪一种。
• 检查检测结果：查看轮廓。细胞核被合并会使计数偏低，被拆分会使计数偏高；拥挤的组织需要深度学习检测器或调整后的设置。
• 足够的细胞，正确的 n：每个样本评分数百个细胞，并以每只动物或每位患者的一个数值进行统计，而不是以细胞或视野为单位。
• 完整报告：软件及版本、染色向量、阈值、区域选择规则、计数的细胞数，以及由谁核查了结果。

常见问题

资料来源

• QuPath 文档：细胞检测、Positive cell detection 和 Score compartment
• QuPath 文档：细胞分类、强度阈值、Positive % 和 H-score
• ImageJ 文档：Colour Deconvolution（Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299）
• Landini G. Colour Deconvolution 2：H DAB 向量，以及为什么 DAB 的深浅不能衡量抗原的量
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

本指南用于科研和教学。它不是诊断程序：用于患者诊疗的评分须遵循经过验证的检测方法、该标记物的现行指南以及病理医生的判断。