So quantifizieren Sie eine IHC-Färbung

Entscheiden, was gemessen wird

Legen Sie die Messgröße fest, bevor Sie die Ergebnisse ansehen, und verwenden Sie für jede Probe dieselbe. Für einen zählbasierten Index zeigt der Ki-67-Index-Rechner, wie weit eine Zählung einer bestimmten Größe danebenliegen kann.

Software für die IHC-Quantifizierung

Einen breiteren Vergleich von Analysewerkzeugen finden Sie im Vergleich von Software für die Mikroskopie-Bildanalyse.

So quantifizieren Sie IHC in QuPath

1. Öffnen Sie das Präparat und setzen Sie den Bildtyp auf Brightfield (H-DAB), damit QuPath Hämatoxylin von DAB trennt.
2. Zeichnen Sie eine Annotation um das zu bewertende Gewebe. Bewerten Sie nicht das ganze Bild: Falten, Ränder und Hintergrund verzerren das Ergebnis.
3. Führen Sie Analyze › Cell detection › Positive cell detection auf der Annotation aus. Prüfen Sie, ob die erkannten Zellkerne zum Bild passen, und passen Sie die Erkennungseinstellungen an, wenn Kerne verschmolzen sind oder fehlen.
4. Setzen Sie bei einem nukleären Marker Score compartment auf Nucleus: DAB OD mean. Eine einzelne Schwelle teilt die Zellen in positiv und negativ; mit bis zu drei Schwellen werden sie als schwach, mäßig und stark (1+, 2+, 3+) eingestuft.
5. Lesen Sie Positive % für die Annotation im Tab Annotations ab. Mit drei Schwellen berechnet QuPath auch den H-Score von 0 bis 300.
6. Öffnen Sie Measure › Show annotation measurements, exportieren Sie die Tabelle als CSV für Ihre Statistik und halten Sie die Schwellenwerte in Ihrem Methodenteil fest.

Dieselben Intensitätsschwellen lassen sich nachträglich mit Classify › Object classification › Set cell intensity classifications ändern, ohne die Zellen erneut zu erkennen.

So quantifizieren Sie eine DAB-Färbung in Fiji (ImageJ)

1. Öffnen Sie das Hellfeld-RGB-Bild. Ein ganzes Präparat ist meist zu groß, um es in voller Auflösung zu öffnen; exportieren Sie daher zuerst eine Region oder ein Feld daraus.
2. Führen Sie Image › Color › Colour Deconvolution aus und wählen Sie die Vektoren H DAB. Sie erhalten drei Bilder: Hämatoxylin, DAB und ein Residuum.
3. Für die gefärbte Fläche: Setzen Sie auf dem DAB-Bild einen Schwellenwert mit Image › Adjust › Threshold, aktivieren Sie Area fraction und Limit to threshold unter Analyze › Set Measurements und führen Sie dann Analyze › Measure aus.
4. Für den Anteil positiver Zellen: Zählen Sie die Zellkerne auf dem Hämatoxylin- und dem DAB-Bild (Schwellenwert, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) und teilen Sie dann die positiven Kerne durch alle Kerne.
5. Verwenden Sie für jedes Bild dieselben Schwellenwerte und zeichnen Sie die Schritte als Makro auf, damit die Stapelverarbeitung reproduzierbar ist.

Der Autor des Plugins warnt davor, die Dunkelheit des DAB-Signals als Antigenmenge zu lesen: DAB folgt nicht dem Lambert-Beer-Gesetz, und Immunfärbung ist nicht stöchiometrisch. Vergleichen Sie Intensitäten nur innerhalb eines Färbelaufs, und zählen Sie lieber positive Zellen oder messen Sie Flächen, statt rohe Dunkelheit zu vergleichen.

So bewerten Sie IHC in SlideScope (ohne Code)

1. Öffnen Sie das Präparat in SlideScope unter Windows oder auf dem Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF und die anderen unterstützten Formate) und zeichnen Sie die zu bewertende Region ein oder zoomen Sie auf sie.
2. Öffnen Sie Quantify, setzen Sie Objects auf Zellkerne und Stains auf Hematoxylin + DAB (IHC). Wenn die Farben Ihrer Färbung von den Standardwerten abweichen, schätzen Sie die Färbevektoren aus dem Präparat.
3. Aktivieren Sie unter Marker classification die Option Classify marker-positive objects mit DAB als positivem Marker. Die drei Grad-Schwellen (1+, 2+, 3+, in optischer Dichte) beginnen bei 0,2; 0,4 und 0,6 und lassen sich bearbeiten.
4. Starten Sie die Analyse. Jeder Zellkern wird auf dem Bild umrandet, sodass Sie das Ergebnis prüfen, die Klasse eines Kerns korrigieren oder alles ausschließen können, was falsch erkannt wurde.
5. Lesen Sie Positivanteil, H-Score, Allred-Score und positive Zellen pro mm² für die Region ab und exportieren Sie dann die Objekttabelle (CSV), die Umrisse (GeoJSON, das QuPath öffnet) und eine Methodenzusammenfassung.

Oder tippen Sie die Frage ein. Mit Ask Your Slide können Sie fragen: „Wie viel Prozent der Zellkerne sind in dieser Region Ki67-positiv?“ oder „Nenne mir H-Score und Allred-Score für den Bereich, den ich umrandet habe“, und SlideScope führt dieselben Werkzeuge auf Ihrem Computer aus und zeigt die Belege für jede Zahl. Die Scores verwenden dieselben Definitionen wie QuPath, sodass beide bei denselben Zellen übereinstimmen. Das Scoring stuft Zellkerne ein und eignet sich daher für nukleäre Marker; die Ergebnisse sind für Forschungszwecke bestimmt und müssen von Ihnen visuell geprüft werden. Mehr dazu auf der Seite zur Zählung.

Was darüber entscheidet, ob die Zahl stimmt

• Wo der Marker sitzt: Kernbasiertes Scoring eignet sich für nukleäre Marker wie Ki-67, ER, PR und p53. Membranmarker (HER2, PD-L1) und zytoplasmatische Marker erfordern eine Messung der Färbung im jeweiligen Kompartiment, und ihr klinisches Scoring folgt dem Handbuch des jeweiligen Assays.
• Schwellenwerte an Kontrollen festlegen: Legen Sie die Positivschwelle an Kontrollgewebe aus demselben Färbelauf fest, bevor Sie das Experiment bewerten, und passen Sie sie nie pro Präparat an.
• Die Region: Bewerten Sie das Gewebe, um das es in der Fragestellung geht, und lassen Sie Nekrosen, Falten, Randfärbung und Stroma weg, sofern das Protokoll sie nicht einschließt. Hotspots und ganze Schnitte ergeben unterschiedliche Zahlen; geben Sie an, was Sie verwendet haben.
• Die Erkennung prüfen: Sehen Sie sich die Umrisse an. Verschmolzene Kerne senken die Zahl, geteilte Kerne erhöhen sie; dicht gepacktes Gewebe braucht einen Deep-Learning-Detektor oder angepasste Einstellungen.
• Genügend Zellen, das richtige n: Bewerten Sie mehrere hundert Zellen pro Probe und rechnen Sie die Statistik mit einem Wert pro Tier oder Patient, nicht mit Zellen oder Feldern.
• Dokumentieren: Software und Version, Färbevektoren, Schwellenwerte, die Regel für die Region, gezählte Zellen und wer das Ergebnis geprüft hat.

Fragen

Quellen

• QuPath-Dokumentation: Zellerkennung, Positive cell detection und Score compartment
• QuPath-Dokumentation: Zellklassifizierung, Intensitätsschwellen, Positive % und H-Score
• ImageJ-Dokumentation: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: die Vektoren H DAB und warum die Dunkelheit von DAB kein Maß für Antigen ist
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Dieser Leitfaden dient Forschung und Lehre. Er ist kein diagnostisches Verfahren: Das Scoring für die Patientenversorgung folgt dem validierten Assay, der aktuellen Leitlinie für den jeweiligen Marker und dem Urteil einer Pathologin oder eines Pathologen.