如何定量 IHC 染色

決定要量測什麼

請在查看結果之前選定量測指標，並對每個樣本使用同一個指標。對於以計數為基礎的指數，Ki-67 指數計算器可顯示一定數量的計數可能偏差多少。

IHC 定量軟體

更廣泛的分析工具比較，請參閱顯微影像分析軟體比較。

如何在 QuPath 中定量 IHC

1. 開啟玻片，將影像類型設為 Brightfield (H-DAB)，讓 QuPath 將蘇木素與 DAB 分開。
2. 在要評分的組織周圍繪製標註。避免為整張影像評分：皺摺、邊緣與背景會使結果失真。
3. 在該標註上執行 Analyze › Cell detection › Positive cell detection。檢查偵測到的細胞核是否與影像相符；若細胞核被合併或遺漏，請調整偵測設定。
4. 若為細胞核標記，請將 Score compartment 設為 Nucleus: DAB OD mean。單一閾值將細胞分為陽性與陰性；最多三個閾值可將其分級為弱、中度與強（1+、2+、3+）。
5. 在 Annotations 分頁中讀取該標註的 Positive %。使用三個閾值時，QuPath 也會算出 0 到 300 的 H-score。
6. 開啟 Measure › Show annotation measurements，將表格匯出為 CSV 以進行統計，並在方法章節中記錄閾值。

之後可透過 Classify › Object classification › Set cell intensity classifications 更改同一組強度閾值，不必重新偵測細胞。

如何在 Fiji（ImageJ）中定量 DAB 染色

1. 開啟明視野 RGB 影像。全玻片影像通常太大，無法以完整解析度開啟，因此請先從中匯出一個區域或視野。
2. 執行 Image › Color › Colour Deconvolution，並選擇 H DAB 向量。您會得到三張影像：蘇木素、DAB 與殘差。
3. 量測染色面積：在 DAB 影像上以 Image › Adjust › Threshold 設定閾值，在 Analyze › Set Measurements 中勾選 Area fraction 與 Limit to threshold，再執行 Analyze › Measure。
4. 計算陽性細胞百分比：在蘇木素與 DAB 影像上計數細胞核（閾值、Process › Binary › Watershed、Analyze › Analyze Particles），再將陽性細胞核數除以全部細胞核數。
5. 每張影像都使用相同的閾值，並將步驟錄製為巨集，讓批次處理可以重現。

此外掛程式的作者提醒，不應把 DAB 的深淺解讀為抗原的量：DAB 不遵循 Beer-Lambert 定律，免疫染色也不符合化學計量關係。請只在同一染色批次內比較強度，並優先計數陽性細胞或量測面積，而非比較原始的深淺。

如何在 SlideScope 中進行 IHC 評分（免寫程式碼）

1. 在 Windows 或 Mac 上以 SlideScope 開啟玻片（SVS、NDPI、MRXS、CZI、TIFF 及其支援的其他格式），然後繪製或縮放至要評分的區域。
2. 開啟 Quantify，將 Objects 設為細胞核，Stains 設為 Hematoxylin + DAB (IHC)。若您的染色顏色與預設值不同，請從玻片估算染色向量。
3. 在 Marker classification 下，開啟 Classify marker-positive objects，並以 DAB 作為陽性標記。三個分級閾值（1+、2+、3+，以光密度表示）預設為 0.2、0.4 與 0.6，可以修改。
4. 執行分析。每個細胞核都會在影像上描出輪廓，方便您檢查結果、更正某個細胞核的分類，或排除任何誤判的物件。
5. 讀取該區域的陽性百分比、H-score、Allred 分數與每 mm² 陽性細胞數，再匯出物件表（CSV）、輪廓（GeoJSON，可在 QuPath 中開啟）與方法摘要。

也可以直接輸入問題。透過 Ask Your Slide，您可以問「這個區域中有百分之多少的細胞核是 Ki67 陽性？」或「給我圈選區域的 H-score 與 Allred 分數」，SlideScope 會在您的電腦上執行這些相同的工具，並為每個數字呈現依據。分數採用與 QuPath 相同的定義，因此兩者對相同細胞的結果一致。評分以細胞核為單位分級，適用於細胞核標記；結果僅供研究使用，並需要您以肉眼核對。詳見計數頁面。

決定數字是否正確的因素

• 標記所在的位置：以細胞核為基礎的評分適用於 Ki-67、ER、PR 與 p53 等細胞核標記。細胞膜標記（HER2、PD-L1）與細胞質標記需在相應的區室量測染色，其臨床評分則依循該檢測本身的使用手冊。
• 以對照組織設定閾值：在為實驗評分之前，以同一染色批次的對照組織設定陽性閾值，且絕不逐張玻片調整。
• 區域：為研究問題所關注的組織評分；除非實驗方案涵蓋，否則排除壞死、皺摺、邊緣染色與間質。熱點與整張切片會得到不同的數字；請註明您採用哪一種。
• 檢查偵測結果：查看輪廓。細胞核被合併會使計數偏低，被切分則會使計數偏高；擁擠的組織需要深度學習偵測器或調整過的設定。
• 足夠的細胞、正確的 n：每個樣本評分數百個細胞，並以每隻動物或每位病人的一個數值進行統計，而非以細胞或視野為單位。
• 完整回報：軟體與版本、染色向量、閾值、區域選擇規則、計數的細胞數，以及由誰核對結果。

常見問題

資料來源

• QuPath 說明文件：細胞偵測、Positive cell detection 與 Score compartment
• QuPath 說明文件：細胞分類、強度閾值、Positive % 與 H-score
• ImageJ 說明文件：Colour Deconvolution（Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299）
• Landini G. Colour Deconvolution 2：H DAB 向量，以及為何 DAB 的深淺不能代表抗原的量
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

本指南供研究與教學使用。它不是診斷程序：用於病人照護的評分，應依循經過確效的檢測、該標記的現行指引，以及病理科醫師的判斷。