איך לכמת צביעת IHC

החליטו מה למדוד

בחרו את המדד לפני שאתם מסתכלים בתוצאות, והשתמשו באותו מדד לכל הדגימות. למדד מבוסס ספירה, מחשבון מדד Ki-67 מראה עד כמה ספירה בגודל נתון עלולה לסטות.

תוכנות לכימות IHC

השוואה רחבה יותר של כלי ניתוח נמצאת בהשוואת התוכנות לניתוח תמונות מיקרוסקופיה.

איך לכמת IHC ב-QuPath

1. פתחו את השקופית והגדירו את סוג התמונה ל-Brightfield (H-DAB), כדי ש-QuPath יפריד בין המטוקסילין ל-DAB.
2. ציירו אנוטציה סביב הרקמה לניקוד. הימנעו מניקוד התמונה כולה: קפלים, שוליים ורקע מטים את התוצאה.
3. הריצו Analyze › Cell detection › Positive cell detection על האנוטציה. בדקו שהגרעינים שזוהו תואמים לתמונה, ושנו את הגדרות הזיהוי אם גרעינים מתמזגים או מתפספסים.
4. לסמן גרעיני, הגדירו את Score compartment ל-Nucleus: DAB OD mean. סף אחד מחלק את התאים לחיוביים ושליליים; עד שלושה ספים מדרגים אותם לחלשים, בינוניים וחזקים (1+,‏ 2+,‏ 3+).
5. קראו את Positive % של האנוטציה בלשונית Annotations. עם שלושה ספים QuPath מחשב גם את ה-H-score, מ-0 עד 300.
6. פתחו את Measure › Show annotation measurements, ייצאו את הטבלה ל-CSV לניתוח הסטטיסטי, ורשמו את הספים בפרק השיטות.

אפשר לשנות את אותם ספי עוצמה גם בדיעבד עם Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, בלי לזהות את התאים מחדש.

איך לכמת צביעת DAB ב-Fiji ‏(ImageJ)

1. פתחו את תמונת ה-RGB בשדה בהיר. שקופית שלמה בדרך כלל גדולה מכדי להיפתח ברזולוציה מלאה, לכן ייצאו ממנה קודם אזור או שדה.
2. הריצו Image › Color › Colour Deconvolution ובחרו את הווקטורים H DAB. מתקבלות שלוש תמונות: המטוקסילין, DAB ושארית.
3. לשטח הצבוע: בתמונת ה-DAB הגדירו סף עם Image › Adjust › Threshold, סמנו Area fraction ו-Limit to threshold תחת Analyze › Set Measurements, ואז Analyze › Measure.
4. לאחוז התאים החיוביים: ספרו גרעינים בתמונות ההמטוקסילין וה-DAB (סף, Process › Binary › Watershed,‏ Analyze › Analyze Particles), ואז חלקו את הגרעינים החיוביים בכל הגרעינים.
5. השתמשו באותם ערכי סף לכל תמונה, והקליטו את הצעדים כמאקרו כדי שהאצווה תהיה ניתנת לשחזור.

מחבר התוסף מזהיר מפני קריאת הכהות של DAB ככמות של אנטיגן: DAB אינו מציית לחוק Beer-Lambert, וצביעה חיסונית אינה סטויכיומטרית. השוו עוצמה רק בתוך הרצת צביעה אחת, והעדיפו ספירת תאים חיוביים או מדידת שטח על פני השוואת כהות גולמית.

איך לנקד IHC ב-SlideScope (בלי קוד)

1. פתחו את השקופית ב-SlideScope ב-Windows או ב-Mac ‏(SVS,‏ NDPI,‏ MRXS,‏ CZI,‏ TIFF ושאר הפורמטים שהוא קורא), וציירו את האזור לניקוד או התקרבו אליו.
2. פתחו את Quantify, הגדירו את Objects לגרעינים ואת Stains ל-Hematoxylin + DAB (IHC). אם הצבעים של הצביעה שלכם שונים מברירות המחדל, העריכו את וקטורי הצבע מתוך השקופית.
3. תחת Marker classification, הפעילו את Classify marker-positive objects עם DAB כסמן החיובי. שלושת ספי הדרגות (1+,‏ 2+,‏ 3+, בצפיפות אופטית) מתחילים ב-0.2,‏ 0.4 ו-0.6 וניתנים לעריכה.
4. הריצו. כל גרעין מסומן בקו מתאר על התמונה, כך שתוכלו לבדוק את התוצאה, לתקן את הסיווג של גרעין או להוציא כל דבר שנקרא לא נכון.
5. קראו את אחוז החיוביים, ה-H-score, ציון Allred והתאים החיוביים למ"מ² עבור האזור, ואז ייצאו את טבלת האובייקטים (CSV), את קווי המתאר (GeoJSON, ש-QuPath פותח) וסיכום שיטות.

או הקלידו את השאלה. עם Ask Your Slide אפשר לשאול “איזה אחוז מהגרעינים באזור הזה חיובי ל-Ki67?” או “תן לי את ה-H-score ואת ציון ה-Allred לאזור שסימנתי”, ו-SlideScope מריץ את אותם כלים במחשב שלכם ומציג את הראיות לכל מספר. הציונים משתמשים באותן הגדרות כמו QuPath, כך ששניהם מסכימים על אותם תאים. הניקוד מדרג גרעינים, ולכן מתאים לסמנים גרעיניים; התוצאות מיועדות לשימוש מחקרי ודורשות את הבדיקה החזותית שלכם. עוד בדף הספירה.

מה קובע אם המספר נכון

• היכן הסמן נמצא: ניקוד מבוסס גרעינים מתאים לסמנים גרעיניים כמו Ki-67,‏ ER,‏ PR ו-p53. סמני ממברנה (HER2,‏ PD-L1) וסמנים ציטופלזמיים דורשים מדידה של הצביעה באותו מדור, והניקוד הקליני שלהם נעשה לפי המדריך של הבדיקה עצמה.
• ספים שנקבעים על ביקורות: קבעו את סף החיוביות על רקמת ביקורת מאותה הרצת צביעה, לפני ניקוד הניסוי, ולעולם אל תשנו אותו משקופית לשקופית.
• האזור: נקדו את הרקמה שהשאלה עוסקת בה, והשאירו בחוץ נמק, קפלים, צביעת שוליים וסטרומה, אלא אם הפרוטוקול כולל אותם. מוקדים חמים וחתכים שלמים נותנים מספרים שונים; ציינו במה השתמשתם.
• בדקו את הזיהוי: הסתכלו על קווי המתאר. גרעינים מתמזגים מורידים את הספירה וגרעינים מפוצלים מעלים אותה; רקמה צפופה דורשת גלאי מבוסס למידה עמוקה או הגדרות מותאמות.
• מספיק תאים, ה-n הנכון: נקדו כמה מאות תאים לכל דגימה, והריצו סטטיסטיקה על ערך אחד לכל בעל חיים או מטופל, לא על תאים או שדות.
• דווחו: תוכנה וגרסה, וקטורי צבע, ספים, כלל בחירת האזור, מספר התאים שנספרו ומי בדק את התוצאה.

שאלות

מקורות

• התיעוד של QuPath: זיהוי תאים, Positive cell detection ו-Score compartment
• התיעוד של QuPath: סיווג תאים, ספי עוצמה, Positive % ו-H-score
• התיעוד של ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: וקטורי H DAB, ולמה כהות DAB אינה מדד לאנטיגן
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

המדריך הזה נועד למחקר ולהוראה. הוא אינו הליך אבחוני: ניקוד לצורך טיפול בחולים נעשה לפי הבדיקה המתוקפת, ההנחיה העדכנית לאותו סמן ושיקול דעתו של פתולוג.