Як кількісно оцінити ІГХ-забарвлення

Вирішіть, що вимірювати

Оберіть показник до того, як подивитеся на результати, і використовуйте той самий для всіх зразків. Для індексу на основі підрахунку калькулятор індексу Ki-67 показує, наскільки може помилятися підрахунок заданого розміру.

Програми для кількісної оцінки ІГХ

Ширше порівняння програм аналізу наведено на сторінці порівняння програм для аналізу мікроскопічних зображень.

Як кількісно оцінити ІГХ у QuPath

1. Відкрийте слайд і задайте тип зображення Brightfield (H-DAB), щоб QuPath відокремив гематоксилін від DAB.
2. Намалюйте анотацію навколо тканини, яку потрібно оцінити. Не оцінюйте зображення повністю: складки, краї та фон спотворюють результат.
3. Запустіть Analyze › Cell detection › Positive cell detection для анотації. Перевірте, чи знайдені ядра відповідають зображенню, і скоригуйте параметри виявлення, якщо ядра злилися або пропущені.
4. Для ядерного маркера задайте для Score compartment значення Nucleus: DAB OD mean. Один поріг ділить клітини на позитивні й негативні; до трьох порогів ділять їх на слабкі, помірні й сильні (1+, 2+, 3+).
5. Прочитайте Positive % для анотації на вкладці Annotations. З трьома порогами QuPath також розраховує H-score від 0 до 300.
6. Відкрийте Measure › Show annotation measurements, експортуйте таблицю в CSV для статистичної обробки й зазначте пороги в розділі методів.

Ті самі пороги інтенсивності можна змінити пізніше через Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, не виявляючи клітини заново.

Як кількісно оцінити забарвлення DAB у Fiji (ImageJ)

1. Відкрийте RGB-зображення, зняте у світлому полі. Цілий слайд зазвичай завеликий, щоб відкрити його в повній роздільній здатності, тому спершу експортуйте з нього ділянку або поле.
2. Запустіть Image › Color › Colour Deconvolution і виберіть вектори H DAB. Ви отримаєте три зображення: гематоксилін, DAB і залишок.
3. Для забарвленої площі: на зображенні DAB задайте поріг через Image › Adjust › Threshold, позначте Area fraction і Limit to threshold в Analyze › Set Measurements, потім виконайте Analyze › Measure.
4. Для відсотка позитивних клітин: порахуйте ядра на зображеннях гематоксиліну та DAB (поріг, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), потім поділіть кількість позитивних ядер на кількість усіх ядер.
5. Використовуйте однакові значення порогу для всіх зображень і запишіть кроки в макрос, щоб обробку серії можна було повторити.

Автор плагіна застерігає від того, щоб вважати темність DAB мірою кількості антигену: DAB не підкоряється закону Бера — Ламберта, а імунозабарвлення не стехіометричне. Порівнюйте інтенсивність лише в межах однієї серії забарвлення і надавайте перевагу підрахунку позитивних клітин або вимірюванню площі, а не порівнянню «сирої» темності.

Як оцінити ІГХ у SlideScope (без коду)

1. Відкрийте слайд у SlideScope у Windows або на Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF та інші підтримувані формати) і намалюйте ділянку для оцінки або наблизьте її.
2. Відкрийте Quantify, виберіть в Objects ядра, а в Stains — Hematoxylin + DAB (IHC). Якщо кольори вашого забарвлення відрізняються від стандартних, оцініть вектори барвників за слайдом.
3. У розділі Marker classification увімкніть Classify marker-positive objects і виберіть DAB як позитивний маркер. Три пороги ступенів (1+, 2+, 3+, в одиницях оптичної густини) за замовчуванням дорівнюють 0.2, 0.4 і 0.6, і їх можна змінити.
4. Запустіть аналіз. Кожне ядро обводиться на зображенні, тож ви можете перевірити результат, виправити клас ядра або виключити те, що розпізнано неправильно.
5. Прочитайте для ділянки відсоток позитивних клітин, H-score, бал Allred і кількість позитивних клітин на мм², потім експортуйте таблицю об’єктів (CSV), контури (GeoJSON, який відкриває QuPath) і зведення методів.

Або поставте запитання. З Ask Your Slide можна запитати: «Який відсоток ядер у цій ділянці Ki67-позитивний?» або «Дай H-score і бал Allred для обведеної ділянки», і SlideScope виконає ці самі інструменти на вашому комп’ютері й покаже докази для кожного числа. Бали використовують ті самі визначення, що й QuPath, тому на тих самих клітинах результати збігаються. Оцінка присвоює ступені ядрам, що підходить для ядерних маркерів; результати призначені для досліджень і потребують вашої візуальної перевірки. Докладніше на сторінці підрахунку.

Від чого залежить, чи правильне число

• Де розташований маркер: оцінка за ядрами підходить для ядерних маркерів, таких як Ki-67, ER, PR і p53. Для мембранних (HER2, PD-L1) і цитоплазматичних маркерів забарвлення потрібно вимірювати у відповідному компартменті, а їхня клінічна оцінка відбувається за інструкцією до самого тесту.
• Пороги задають на контролях: зафіксуйте поріг позитивності на контрольній тканині з тієї самої серії забарвлення до оцінки експерименту і ніколи не підлаштовуйте його під окремий слайд.
• Ділянка: оцінюйте ту тканину, якої стосується питання, і виключайте некроз, складки, крайове забарвлення та строму, якщо протокол їх не включає. Гарячі точки й цілі зрізи дають різні числа; зазначте, що ви використали.
• Перевіряйте виявлення: дивіться на контури. Злиті ядра занижують підрахунок, а розділені — завищують; для щільної тканини потрібен детектор на основі глибокого навчання або скориговані параметри.
• Достатньо клітин і правильне n: оцінюйте кілька сотень клітин на зразок, а статистику проводьте за одним значенням на тварину чи пацієнта, а не за клітинами чи полями.
• Зазначайте у звіті: програму та її версію, вектори барвників, пороги, правило вибору ділянки, кількість порахованих клітин і хто перевіряв результат.

Запитання

Джерела

• Документація QuPath: виявлення клітин, Positive cell detection і Score compartment
• Документація QuPath: класифікація клітин, пороги інтенсивності, Positive % і H-score
• Документація ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: вектори H DAB і чому темність DAB не є мірою кількості антигену
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Цей посібник призначений для досліджень і навчання. Він не є діагностичною процедурою: оцінка для лікування пацієнтів ґрунтується на валідованому тесті, чинних рекомендаціях для цього маркера та судженні патолога.