Como quantificar a coloração de IHQ

Decida o que medir

Escolha a medida antes de olhar para os resultados e use a mesma em todas as amostras. Para um índice baseado em contagens, a calculadora do índice Ki-67 mostra quanto uma contagem de determinada dimensão se pode desviar.

Software para quantificação de IHQ

Uma comparação mais ampla de ferramentas de análise está em comparação de software de análise de imagens de microscopia.

Como quantificar IHQ no QuPath

1. Abra a lâmina e defina o tipo de imagem como Brightfield (H-DAB), para que o QuPath separe a hematoxilina da DAB.
2. Desenhe uma anotação à volta do tecido a pontuar. Evite pontuar a imagem inteira: dobras, bordos e fundo enviesam o resultado.
3. Execute Analyze › Cell detection › Positive cell detection na anotação. Verifique se os núcleos detetados correspondem à imagem e ajuste as definições de deteção se houver núcleos fundidos ou não detetados.
4. Para um marcador nuclear, defina Score compartment como Nucleus: DAB OD mean. Um único limiar divide as células em positivas e negativas; até três limiares graduam-nas como fracas, moderadas e fortes (1+, 2+, 3+).
5. Leia a Positive % da anotação no separador Annotations. Com três limiares, o QuPath calcula também o H-score, de 0 a 300.
6. Abra Measure › Show annotation measurements, exporte a tabela para CSV para a sua análise estatística e registe os limiares nos seus métodos.

Os mesmos limiares de intensidade podem ser alterados depois com Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, sem voltar a detetar as células.

Como quantificar a coloração de DAB no Fiji (ImageJ)

1. Abra a imagem RGB de campo claro. Uma lâmina inteira é normalmente demasiado grande para abrir em resolução total, por isso exporte primeiro uma região ou um campo.
2. Execute Image › Color › Colour Deconvolution e escolha os vetores H DAB. Obtém três imagens: hematoxilina, DAB e um resíduo.
3. Para a área corada: na imagem de DAB, defina um limiar com Image › Adjust › Threshold, assinale Area fraction e Limit to threshold em Analyze › Set Measurements e depois execute Analyze › Measure.
4. Para a percentagem de células positivas: conte os núcleos nas imagens de hematoxilina e de DAB (limiar, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) e depois divida os núcleos positivos por todos os núcleos.
5. Use os mesmos valores de limiar em todas as imagens e grave os passos como macro para que o lote seja reprodutível.

O autor do plugin desaconselha ler a intensidade escura da DAB como uma quantidade de antigénio: a DAB não segue a lei de Beer-Lambert e a imunomarcação não é estequiométrica. Compare a intensidade apenas dentro de uma mesma série de coloração e, em vez de comparar a intensidade escura em bruto, prefira contar células positivas ou medir a área.

Como pontuar IHQ no SlideScope (sem código)

1. Abra a lâmina no SlideScope em Windows ou Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF e os outros formatos que lê) e desenhe a região a pontuar ou aproxime-se dela com o zoom.
2. Abra Quantify, defina Objects como núcleos e Stains como Hematoxylin + DAB (IHC). Se as cores da sua coloração forem diferentes das predefinidas, estime os vetores de coloração a partir da lâmina.
3. Em Marker classification, ative Classify marker-positive objects com a DAB como marcador positivo. Os três limiares de grau (1+, 2+, 3+, em densidade ótica) começam em 0,2, 0,4 e 0,6 e podem ser editados.
4. Execute. Cada núcleo fica contornado na imagem, para poder verificar o resultado, corrigir a classe de um núcleo ou excluir o que tiver sido mal interpretado.
5. Leia a percentagem de positivos, o H-score, a pontuação de Allred e as células positivas por mm² da região e depois exporte a tabela de objetos (CSV), os contornos (GeoJSON, que o QuPath abre) e um resumo dos métodos.

Ou escreva a pergunta. Com o Ask Your Slide pode perguntar «que percentagem de núcleos é Ki67 positiva nesta região?» ou «dê-me o H-score e a pontuação de Allred da área que delimitei», e o SlideScope executa estas mesmas ferramentas no seu computador e mostra as provas de cada número. As pontuações usam as mesmas definições do QuPath, pelo que os dois coincidem nas mesmas células. A pontuação gradua núcleos, o que se adequa a marcadores nucleares; os resultados destinam-se a uso em investigação e exigem a sua verificação visual. Mais informação na página de contagem.

O que determina se o número está certo

• Onde se localiza o marcador: a pontuação baseada no núcleo adequa-se a marcadores nucleares como Ki-67, RE, RP e p53. Os marcadores de membrana (HER2, PD-L1) e citoplasmáticos exigem que a coloração seja medida nesse compartimento, e a sua pontuação clínica segue o manual do próprio ensaio.
• Limiares definidos em controlos: fixe o limiar de positividade em tecido de controlo da mesma série de coloração, antes de pontuar a experiência, e nunca o ajuste lâmina a lâmina.
• A região: pontue o tecido a que a pergunta diz respeito e exclua necrose, dobras, coloração de bordo e estroma, salvo se o protocolo os incluir. Hot spots e cortes inteiros dão números diferentes; indique qual usou.
• Verifique a deteção: observe os contornos. Núcleos fundidos baixam a contagem e núcleos divididos aumentam-na; tecido muito denso precisa de um detetor de aprendizagem profunda ou de definições ajustadas.
• Células suficientes e o n certo: pontue várias centenas de células por amostra e faça a estatística com um valor por animal ou doente, não por célula nem por campo.
• Registe-o: software e versão, vetores de coloração, limiares, a regra de escolha da região, células contadas e quem verificou o resultado.

Perguntas

Fontes

• Documentação do QuPath: deteção de células, Positive cell detection e Score compartment
• Documentação do QuPath: classificação celular, limiares de intensidade, Positive % e H-score
• Documentação do ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: os vetores H DAB e porque é que a intensidade escura da DAB não é uma medida de antigénio
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Este guia destina-se a investigação e ensino. Não é um procedimento de diagnóstico: a pontuação para cuidados ao doente segue o ensaio validado, a orientação em vigor para esse marcador e o critério de um patologista.