IHC 염색 정량 방법

무엇을 측정할지 정하기

결과를 보기 전에 측정값을 고르고, 모든 시료에 같은 측정값을 쓰세요. 계수 기반 지수라면 Ki-67 지수 계산기로 주어진 크기의 계수가 얼마나 벗어날 수 있는지 확인할 수 있습니다.

IHC 정량용 소프트웨어

분석 도구에 대한 더 넓은 비교는 현미경 이미지 분석 소프트웨어 비교에 있습니다.

QuPath에서 IHC를 정량하는 방법

1. 슬라이드를 열고 이미지 유형을 Brightfield (H-DAB)로 설정해, QuPath가 헤마톡실린과 DAB를 분리하도록 합니다.
2. 점수를 매길 조직 주위에 주석(annotation)을 그립니다. 이미지 전체에 점수를 매기는 것은 피하세요. 주름, 가장자리, 배경이 결과를 왜곡합니다.
3. 주석에서 Analyze › Cell detection › Positive cell detection을 실행합니다. 검출된 핵이 이미지와 맞는지 확인하고, 핵이 합쳐지거나 누락되었다면 검출 설정을 조정합니다.
4. 핵 마커라면 Score compartment를 Nucleus: DAB OD mean으로 설정합니다. 임계값 하나는 세포를 양성과 음성으로 나누고, 임계값을 최대 세 개까지 두면 약양성, 중등도 양성, 강양성(1+, 2+, 3+)으로 등급을 매깁니다.
5. Annotations 탭에서 주석의 Positive %를 읽습니다. 임계값이 세 개이면 QuPath는 0~300의 H-score도 계산합니다.
6. Measure › Show annotation measurements를 열고, 통계 분석을 위해 표를 CSV로 내보낸 다음, 임계값을 방법(Methods) 항목에 기록합니다.

같은 강도 임계값은 세포를 다시 검출하지 않고도 나중에 Classify › Object classification › Set cell intensity classifications에서 바꿀 수 있습니다.

Fiji(ImageJ)에서 DAB 염색을 정량하는 방법

1. 명시야 RGB 이미지를 엽니다. 전체 슬라이드는 대개 너무 커서 최대 해상도로 열 수 없으므로, 먼저 영역이나 시야를 내보내세요.
2. Image › Color › Colour Deconvolution을 실행하고 H DAB 벡터를 선택합니다. 헤마톡실린, DAB, 잔차의 세 이미지가 만들어집니다.
3. 염색 면적: DAB 이미지에서 Image › Adjust › Threshold로 임계값을 설정하고, Analyze › Set Measurements에서 Area fraction과 Limit to threshold에 체크한 다음 Analyze › Measure를 실행합니다.
4. 양성률: 헤마톡실린 이미지와 DAB 이미지에서 핵을 센 다음(임계값, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), 양성 핵 수를 전체 핵 수로 나눕니다.
5. 모든 이미지에 같은 임계값을 쓰고, 단계를 매크로로 기록해 일괄 처리를 재현할 수 있게 하세요.

이 플러그인의 저자는 DAB의 진하기를 항원의 양으로 해석하지 말라고 경고합니다. DAB는 Beer-Lambert 법칙을 따르지 않으며, 면역염색은 화학량론적이지 않습니다. 강도는 한 염색 배치 안에서만 비교하고, 원시 진하기를 비교하기보다는 양성 세포를 세거나 면적을 측정하는 방법을 택하세요.

SlideScope에서 IHC 점수를 매기는 방법(코드 없이)

1. Windows나 Mac의 SlideScope에서 슬라이드를 열고(SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF 등 지원 형식), 점수를 매길 영역을 그리거나 그 영역으로 확대합니다.
2. Quantify를 열고 Objects를 핵(nuclei)으로, Stains를 Hematoxylin + DAB (IHC)로 설정합니다. 염색 색상이 기본값과 다르면 슬라이드에서 염색 벡터를 추정합니다.
3. Marker classification에서 DAB를 양성 마커로 지정해 Classify marker-positive objects를 켭니다. 세 등급 임계값(1+, 2+, 3+, 광학 밀도 단위)은 0.2, 0.4, 0.6에서 시작하며 편집할 수 있습니다.
4. 실행합니다. 각 핵의 윤곽이 이미지 위에 표시되므로 결과를 확인하고, 핵의 분류를 수정하거나 잘못 판독된 것을 제외할 수 있습니다.
5. 영역의 양성률, H-score, Allred 점수, mm²당 양성 세포 수를 읽은 다음, 객체 표(CSV), 윤곽선(QuPath에서 열 수 있는 GeoJSON), 방법 요약을 내보냅니다.

또는 질문을 입력하세요. Ask Your Slide로 “이 영역에서 Ki67 양성 핵은 몇 퍼센트인가요?”나 “내가 표시한 영역의 H-score와 Allred 점수를 알려 주세요”처럼 물으면, SlideScope가 내 컴퓨터에서 같은 도구를 실행하고 모든 숫자의 근거를 보여 줍니다. 점수는 QuPath와 같은 정의를 사용하므로 같은 세포에서는 두 결과가 일치합니다. 점수 산정은 핵에 등급을 매기므로 핵 마커에 적합합니다. 결과는 연구용이며 육안 확인이 필요합니다. 자세한 내용은 계수 페이지를 참고하세요.

숫자가 맞는지를 좌우하는 것

• 마커의 위치: 핵 기반 점수 산정은 Ki-67, ER, PR, p53 같은 핵 마커에 적합합니다. 막 마커(HER2, PD-L1)와 세포질 마커는 해당 구획에서 염색을 측정해야 하며, 이들의 임상 점수 산정은 해당 분석법 자체의 매뉴얼을 따릅니다.
• 대조군으로 임계값 설정: 실험에 점수를 매기기 전에 같은 염색 배치의 대조 조직에서 양성 임계값을 고정하고, 슬라이드마다 조정하지 마세요.
• 영역: 질문의 대상이 되는 조직에 점수를 매기고, 프로토콜에 포함되어 있지 않다면 괴사, 주름, 가장자리 염색, 간질은 제외하세요. 핫스팟과 절편 전체는 다른 숫자를 내므로 어느 쪽을 썼는지 밝히세요.
• 검출 확인: 윤곽선을 보세요. 합쳐진 핵은 개수를 줄이고 쪼개진 핵은 개수를 늘립니다. 세포가 밀집한 조직에는 딥러닝 검출기나 조정된 설정이 필요합니다.
• 충분한 세포와 올바른 n: 시료당 수백 개 세포에 점수를 매기고, 통계는 세포나 시야가 아니라 동물 또는 환자당 하나의 값으로 분석하세요.
• 보고하기: 소프트웨어와 버전, 염색 벡터, 임계값, 영역 선택 규칙, 센 세포 수, 결과를 확인한 사람.

질문

출처

• QuPath 문서 — 세포 검출, Positive cell detection, Score compartment
• QuPath 문서 — 세포 분류, 강도 임계값, Positive %, H-score
• ImageJ 문서 — Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2 — H DAB 벡터, 그리고 DAB의 진하기가 항원 양의 척도가 아닌 이유
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

이 가이드는 연구와 교육용입니다. 진단 절차가 아닙니다. 환자 진료를 위한 점수 산정은 검증된 분석법, 해당 마커의 최신 가이드라인, 그리고 병리의사의 판단을 따릅니다.