Cómo cuantificar la tinción de IHQ

Decide qué medir

Elige la medida antes de ver los resultados y usa la misma para todas las muestras. Para un índice basado en conteos, la calculadora del índice Ki-67 muestra cuánto puede desviarse un conteo de un tamaño dado.

Software para la cuantificación de IHQ

Una comparación más amplia de herramientas de análisis está en la comparación de software de análisis de imágenes de microscopía.

Cómo cuantificar IHQ en QuPath

1. Abre la lámina y configura el tipo de imagen como Brightfield (H-DAB), para que QuPath separe la hematoxilina de la DAB.
2. Dibuja una anotación alrededor del tejido que vas a puntuar. Evita puntuar la imagen completa: los pliegues, los bordes y el fondo sesgan el resultado.
3. Ejecuta Analyze › Cell detection › Positive cell detection sobre la anotación. Revisa que los núcleos detectados coincidan con la imagen y ajusta los parámetros de detección si hay núcleos fusionados o sin detectar.
4. Para un marcador nuclear, configura Score compartment como Nucleus: DAB OD mean. Un solo umbral divide las células en positivas y negativas; hasta tres umbrales las clasifican en débiles, moderadas e intensas (1+, 2+, 3+).
5. Lee el Positive % de la anotación en la pestaña Annotations. Con tres umbrales, QuPath también calcula el H-score, de 0 a 300.
6. Abre Measure › Show annotation measurements, exporta la tabla a CSV para tu análisis estadístico y anota los umbrales en tus métodos.

Los mismos umbrales de intensidad se pueden cambiar después con Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, sin volver a detectar las células.

Cómo cuantificar la tinción de DAB en Fiji (ImageJ)

1. Abre la imagen RGB de campo claro. Una lámina completa suele ser demasiado grande para abrirla a resolución completa, así que primero exporta una región o un campo.
2. Ejecuta Image › Color › Colour Deconvolution y elige los vectores H DAB. Obtienes tres imágenes: hematoxilina, DAB y un residuo.
3. Para el área teñida: en la imagen de DAB, define un umbral con Image › Adjust › Threshold, marca Area fraction y Limit to threshold en Analyze › Set Measurements y luego ejecuta Analyze › Measure.
4. Para el porcentaje de células positivas: cuenta los núcleos en las imágenes de hematoxilina y de DAB (umbral, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) y divide los núcleos positivos entre todos los núcleos.
5. Usa los mismos valores de umbral para todas las imágenes y graba los pasos como macro para que el lote sea reproducible.

El autor del plugin advierte que no se debe interpretar la oscuridad de la DAB como una cantidad de antígeno: la DAB no sigue la ley de Beer-Lambert y la inmunotinción no es estequiométrica. Compara la intensidad solo dentro de una misma corrida de tinción y, en lugar de comparar la oscuridad bruta, prefiere contar células positivas o medir el área.

Cómo puntuar IHQ en SlideScope (sin código)

1. Abre la lámina en SlideScope en Windows o Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF y los demás formatos que lee) y dibuja la región que vas a puntuar o haz zoom hasta ella.
2. Abre Quantify y configura Objects como núcleos y Stains como Hematoxylin + DAB (IHC). Si los colores de tu tinción difieren de los predeterminados, estima los vectores de tinción a partir de la lámina.
3. En Marker classification, activa Classify marker-positive objects con DAB como marcador positivo. Los tres umbrales de grado (1+, 2+, 3+, en densidad óptica) empiezan en 0.2, 0.4 y 0.6 y se pueden editar.
4. Ejecútalo. Cada núcleo queda delimitado sobre la imagen, así que puedes revisar el resultado, corregir la clase de un núcleo o excluir lo que se haya interpretado mal.
5. Lee el porcentaje de positivos, el H-score, la puntuación de Allred y las células positivas por mm² de la región, y luego exporta la tabla de objetos (CSV), los contornos (GeoJSON, que QuPath abre) y un resumen de métodos.

O escribe la pregunta. Con Ask Your Slide puedes preguntar “¿qué porcentaje de núcleos es Ki67 positivo en esta región?” o “dame el H-score y la puntuación de Allred del área que delimité”, y SlideScope ejecuta estas mismas herramientas en tu computadora y muestra la evidencia de cada número. Las puntuaciones usan las mismas definiciones que QuPath, así que ambos coinciden en las mismas células. La puntuación clasifica núcleos, lo que conviene a los marcadores nucleares; los resultados son para uso en investigación y necesitan tu revisión visual. Más información en la página de conteo.

Qué determina que el número sea correcto

• Dónde se ubica el marcador: la puntuación basada en el núcleo es adecuada para marcadores nucleares como Ki-67, RE, RP y p53. Los marcadores de membrana (HER2, PD-L1) y citoplasmáticos requieren medir la tinción en ese compartimento, y su puntuación clínica sigue el manual del propio ensayo.
• Umbrales definidos en controles: fija el umbral de positividad en tejido control de la misma corrida de tinción, antes de puntuar el experimento, y nunca lo ajustes lámina por lámina.
• La región: puntúa el tejido al que se refiere la pregunta y excluye necrosis, pliegues, tinción de borde y estroma, a menos que el protocolo los incluya. Los hot spots y las secciones completas dan números distintos; indica cuál usaste.
• Revisa la detección: mira los contornos. Los núcleos fusionados reducen el conteo y los núcleos divididos lo aumentan; el tejido muy denso necesita un detector de aprendizaje profundo o parámetros ajustados.
• Suficientes células y la n correcta: puntúa varios cientos de células por muestra y haz la estadística con un valor por animal o paciente, no por célula ni por campo.
• Repórtalo: software y versión, vectores de tinción, umbrales, la regla para elegir la región, células contadas y quién revisó el resultado.

Preguntas

Fuentes

• Documentación de QuPath: detección de células, Positive cell detection y Score compartment
• Documentación de QuPath: clasificación celular, umbrales de intensidad, Positive % y H-score
• Documentación de ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: los vectores H DAB y por qué la oscuridad de la DAB no es una medida del antígeno
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Esta guía es para investigación y docencia. No es un procedimiento de diagnóstico: la puntuación para la atención de pacientes sigue el ensayo validado, la guía vigente para ese marcador y el criterio de un patólogo.