Jak kvantifikovat barvení IHC

Rozhodněte, co měřit

Ukazatel zvolte dříve, než se podíváte na výsledky, a u všech vzorků použijte stejný. U indexu založeného na počtu ukazuje kalkulačka indexu Ki-67, nakolik se může mýlit počet dané velikosti.

Software pro kvantifikaci IHC

Širší srovnání analytických nástrojů najdete ve srovnání softwaru pro analýzu mikroskopických snímků.

Jak kvantifikovat IHC v QuPath

1. Otevřete preparát a nastavte typ snímku na Brightfield (H-DAB), aby QuPath oddělil hematoxylin od DAB.
2. Nakreslete anotaci kolem tkáně, kterou chcete hodnotit. Nehodnoťte celý snímek: záhyby, okraje a pozadí výsledek zkreslí.
3. Na anotaci spusťte Analyze › Cell detection › Positive cell detection. Zkontrolujte, že detekovaná jádra odpovídají snímku, a pokud jsou jádra sloučená nebo chybí, upravte nastavení detekce.
4. U jaderného markeru nastavte Score compartment na Nucleus: DAB OD mean. Jeden práh rozdělí buňky na pozitivní a negativní; až tři prahy je odstupňují na slabé, střední a silné (1+, 2+, 3+).
5. Na kartě Annotations odečtěte pro anotaci hodnotu Positive %. Se třemi prahy QuPath vypočítá také H-score od 0 do 300.
6. Otevřete Measure › Show annotation measurements, exportujte tabulku do CSV pro statistiku a prahy si poznamenejte do metod.

Tytéž prahy intenzity lze později změnit pomocí Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, aniž byste buňky znovu detekovali.

Jak kvantifikovat barvení DAB ve Fiji (ImageJ)

1. Otevřete snímek RGB ve světlém poli. Celý preparát je obvykle příliš velký na otevření v plném rozlišení, proto z něj nejprve exportujte oblast nebo pole.
2. Spusťte Image › Color › Colour Deconvolution a zvolte vektory H DAB. Získáte tři snímky: hematoxylin, DAB a reziduum.
3. Pro obarvenou plochu: na snímku DAB nastavte práh pomocí Image › Adjust › Threshold, v Analyze › Set Measurements zaškrtněte Area fraction a Limit to threshold a pak spusťte Analyze › Measure.
4. Pro procento pozitivních buněk: spočítejte jádra na snímcích hematoxylinu a DAB (práh, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) a pak vydělte pozitivní jádra všemi jádry.
5. U všech snímků použijte stejné hodnoty prahu a kroky si nahrajte jako makro, aby byla dávka opakovatelná.

Autor pluginu varuje před tím, aby se tmavost DAB vykládala jako množství antigenu: DAB se neřídí Lambertovým-Beerovým zákonem a imunobarvení není stechiometrické. Intenzitu porovnávejte jen v rámci jedné série barvení a místo porovnávání surové tmavosti raději počítejte pozitivní buňky nebo měřte plochu.

Jak hodnotit IHC ve SlideScope (bez kódu)

1. Otevřete preparát ve SlideScope ve Windows nebo na Macu (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF a další formáty, které čte) a nakreslete oblast k hodnocení nebo na ni přibližte.
2. Otevřete Quantify, nastavte Objects na jádra a Stains na Hematoxylin + DAB (IHC). Pokud se barvy vašeho barvení liší od výchozích, odhadněte vektory barviv z preparátu.
3. V části Marker classification zapněte Classify marker-positive objects s DAB jako pozitivním markerem. Tři prahy stupňů (1+, 2+, 3+, v optické denzitě) začínají na 0,2, 0,4 a 0,6 a lze je upravit.
4. Spusťte výpočet. Každé jádro je na snímku ohraničeno, takže můžete výsledek zkontrolovat, opravit třídu jádra nebo vyřadit cokoli, co bylo určeno špatně.
5. Odečtěte pro oblast procento pozitivních, H-score, skóre Allred a pozitivní buňky na mm² a pak exportujte tabulku objektů (CSV), obrysy (GeoJSON, který otevře QuPath) a souhrn metod.

Nebo napište otázku. S Ask Your Slide se můžete zeptat „kolik procent jader je v této oblasti Ki67-pozitivních?“ nebo „spočítej H-score a skóre Allred pro oblast, kterou jsem vyznačil“ a SlideScope spustí tytéž nástroje ve vašem počítači a ke každému číslu ukáže doklady. Skóre používají stejné definice jako QuPath, takže se oba na stejných buňkách shodnou. Hodnotí se jádra, což se hodí pro jaderné markery; výsledky slouží k výzkumu a vyžadují vaši vizuální kontrolu. Více na stránce o počítání.

Co rozhoduje o tom, zda je číslo správné

• Kde se marker nachází: hodnocení založené na jádrech se hodí pro jaderné markery, jako jsou Ki-67, ER, PR a p53. Membránové markery (HER2, PD-L1) a cytoplazmatické markery vyžadují měření barvení v příslušném kompartmentu a jejich klinické hodnocení se řídí vlastním manuálem daného testu.
• Prahy nastavené na kontrolách: pozitivní práh stanovte na kontrolní tkáni ze stejné série barvení ještě před hodnocením experimentu a nikdy ho neupravujte pro jednotlivé preparáty.
• Oblast: hodnoťte tkáň, které se otázka týká, a vynechte nekrózu, záhyby, barvení okrajů a stroma, pokud je protokol nezahrnuje. Hotspoty a celé řezy dávají různá čísla; uveďte, co jste použili.
• Zkontrolujte detekci: prohlédněte si obrysy. Sloučená jádra počet snižují a rozdělená ho zvyšují; nahloučená tkáň vyžaduje detektor založený na hlubokém učení nebo upravené nastavení.
• Dost buněk, správné n: hodnoťte několik set buněk na vzorek a statistiku počítejte s jednou hodnotou na zvíře nebo pacienta, nikoli s buňkami nebo poli.
• Uveďte: software a verzi, vektory barviv, prahy, pravidlo pro výběr oblasti, počet spočítaných buněk a kdo výsledek kontroloval.

Otázky

Zdroje

• Dokumentace QuPath: detekce buněk, Positive cell detection a Score compartment
• Dokumentace QuPath: klasifikace buněk, prahy intenzity, Positive % a H-score
• Dokumentace ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: vektory H DAB a proč tmavost DAB není mírou množství antigenu
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Tento návod je určen pro výzkum a výuku. Nejde o diagnostický postup: hodnocení pro péči o pacienty se řídí validovaným testem, aktuálním doporučením pro daný marker a úsudkem patologa.