Cómo cuantificar la tinción de IHQ

Decide qué medir

Elige la medida antes de ver los resultados y usa la misma para todas las muestras. Para un índice basado en recuentos, la calculadora del índice Ki-67 muestra cuánto puede desviarse un recuento de un tamaño dado.

Software para la cuantificación de IHQ

Encontrarás una comparativa más amplia de herramientas de análisis en la comparativa de software de análisis de imágenes de microscopía.

Cómo cuantificar IHQ en QuPath

1. Abre el portaobjetos y establece el tipo de imagen en Brightfield (H-DAB), para que QuPath separe la hematoxilina de la DAB.
2. Dibuja una anotación alrededor del tejido que vas a puntuar. Evita puntuar la imagen entera: los pliegues, los bordes y el fondo sesgan el resultado.
3. Ejecuta Analyze › Cell detection › Positive cell detection sobre la anotación. Comprueba que los núcleos detectados coinciden con la imagen y ajusta los parámetros de detección si hay núcleos fusionados o sin detectar.
4. Para un marcador nuclear, ajusta Score compartment a Nucleus: DAB OD mean. Un solo umbral divide las células en positivas y negativas; hasta tres umbrales las gradúan en débiles, moderadas e intensas (1+, 2+, 3+).
5. Lee el Positive % de la anotación en la pestaña Annotations. Con tres umbrales, QuPath también calcula el H-score, de 0 a 300.
6. Abre Measure › Show annotation measurements, exporta la tabla a CSV para tu análisis estadístico y anota los umbrales en tus métodos.

Los mismos umbrales de intensidad pueden cambiarse después con Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, sin volver a detectar las células.

Cómo cuantificar la tinción de DAB en Fiji (ImageJ)

1. Abre la imagen RGB de campo claro. Un portaobjetos completo suele ser demasiado grande para abrirlo a resolución completa, así que exporta antes una región o un campo.
2. Ejecuta Image › Color › Colour Deconvolution y elige los vectores H DAB. Obtendrás tres imágenes: hematoxilina, DAB y un residuo.
3. Para el área teñida: en la imagen de DAB, fija un umbral con Image › Adjust › Threshold, marca Area fraction y Limit to threshold en Analyze › Set Measurements y, después, ejecuta Analyze › Measure.
4. Para el porcentaje de células positivas: cuenta los núcleos en las imágenes de hematoxilina y de DAB (umbral, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) y divide los núcleos positivos entre todos los núcleos.
5. Usa los mismos valores de umbral para todas las imágenes y graba los pasos como macro para que el lote sea reproducible.

El autor del plugin advierte de que no se debe interpretar la oscuridad de la DAB como una cantidad de antígeno: la DAB no sigue la ley de Beer-Lambert y la inmunotinción no es estequiométrica. Compara la intensidad solo dentro de una misma tanda de tinción y, mejor que comparar la oscuridad bruta, cuenta células positivas o mide el área.

Cómo puntuar IHQ en SlideScope (sin código)

1. Abre el portaobjetos en SlideScope en Windows o Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF y los demás formatos que lee) y dibuja la región que vas a puntuar o amplíala.
2. Abre Quantify y ajusta Objects a núcleos y Stains a Hematoxylin + DAB (IHC). Si los colores de tu tinción difieren de los predeterminados, estima los vectores de tinción a partir del portaobjetos.
3. En Marker classification, activa Classify marker-positive objects con DAB como marcador positivo. Los tres umbrales de grado (1+, 2+, 3+, en densidad óptica) empiezan en 0,2; 0,4 y 0,6 y se pueden editar.
4. Ejecútalo. Cada núcleo queda delimitado sobre la imagen, así que puedes comprobar el resultado, corregir la clase de un núcleo o excluir lo que se haya interpretado mal.
5. Lee el porcentaje de positivos, el H-score, la puntuación de Allred y las células positivas por mm² de la región y, después, exporta la tabla de objetos (CSV), los contornos (GeoJSON, que QuPath abre) y un resumen de métodos.

O escribe la pregunta. Con Ask Your Slide puedes preguntar “¿qué porcentaje de núcleos es Ki67-positivo en esta región?” o “dame el H-score y la puntuación de Allred del área que he delimitado”, y SlideScope ejecuta estas mismas herramientas en tu ordenador y muestra las evidencias de cada número. Las puntuaciones usan las mismas definiciones que QuPath, así que ambos coinciden sobre las mismas células. La puntuación gradúa núcleos, lo que conviene a los marcadores nucleares; los resultados son para uso en investigación y requieren tu comprobación visual. Más información en la página de recuento.

Qué determina que el número sea correcto

• Dónde se localiza el marcador: la puntuación basada en el núcleo es adecuada para marcadores nucleares como Ki-67, RE, RP y p53. Los marcadores de membrana (HER2, PD-L1) y citoplasmáticos requieren medir la tinción en ese compartimento, y su puntuación clínica sigue el manual del propio ensayo.
• Umbrales fijados en controles: fija el umbral de positividad en tejido control de la misma tanda de tinción, antes de puntuar el experimento, y nunca lo ajustes para cada portaobjetos.
• La región: puntúa el tejido al que se refiere la pregunta y excluye necrosis, pliegues, tinción de borde y estroma, salvo que el protocolo los incluya. Los hot spots y las secciones completas dan números distintos; indica cuál has usado.
• Revisa la detección: mira los contornos. Los núcleos fusionados reducen el recuento y los núcleos divididos lo aumentan; el tejido muy denso necesita un detector de aprendizaje profundo o parámetros ajustados.
• Suficientes células y la n correcta: puntúa varios cientos de células por muestra y haz la estadística con un valor por animal o paciente, no por célula ni por campo.
• Infórmalo: software y versión, vectores de tinción, umbrales, la regla para elegir la región, células contadas y quién comprobó el resultado.

Preguntas

Fuentes

• Documentación de QuPath: detección de células, Positive cell detection y Score compartment
• Documentación de QuPath: clasificación celular, umbrales de intensidad, Positive % y H-score
• Documentación de ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: los vectores H DAB y por qué la oscuridad de la DAB no es una medida del antígeno
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Esta guía es para investigación y docencia. No es un procedimiento diagnóstico: la puntuación para la atención al paciente sigue el ensayo validado, la guía vigente para ese marcador y el criterio de un patólogo.