IHC क्वांटिफ़िकेशन

IHC स्टेनिंग को कैसे मापें

भूरे इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री स्टेन को एक संख्या में बदलने के लिए चार फ़ैसले लेने होते हैं: क्या मापना है, स्लाइड पर कहाँ, कोई कोशिका पॉज़िटिव कब गिनी जाए, और क्या रिपोर्ट करना है। यह गाइड इन फ़ैसलों से होकर गुज़रती है, फिर QuPath में, Fiji (ImageJ) में और बिना कोड के SlideScope में चरण बताती है।

SlideScope डाउनलोड करेंQuPath में चरण

तय करें कि क्या मापना है

मापयह क्या हैकब उपयोग करें
पॉज़िटिव कोशिकाओं का प्रतिशतपॉज़िटिव कोशिकाएँ ÷ गिनी गई सभी कोशिकाएँ × 100 (एक लेबलिंग इंडेक्स)सवाल यह है कि कितनी कोशिकाएँ मार्कर व्यक्त करती हैं: Ki-67, ER, PR, p53 और अधिकांश न्यूक्लियर मार्कर
H-score (0 से 300)1 × % कमज़ोर + 2 × % मध्यम + 3 × % तीव्रस्टेनिंग की तीव्रता कोशिकाओं के बीच बदलती है और सवाल के लिए मायने रखती है
Allred स्कोर (0 से 8)अनुपात स्कोर (0 से 5) + औसत तीव्रता स्कोर (0 से 3)आप ऐसे प्रोटोकॉल का पालन कर रहे हैं जो इसे रिपोर्ट करता है, पारंपरिक रूप से ब्रेस्ट टिशू में ER और PR
स्टेन हुए क्षेत्रफल का अंशDAB-पॉज़िटिव क्षेत्रफल ÷ टिशू क्षेत्रफल × 100स्टेन केवल गिनने योग्य कोशिकाओं तक सीमित नहीं है: एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स, प्लाक, फ़ाइबर, फैली हुई स्टेनिंग
प्रति mm² पॉज़िटिव कोशिकाएँपॉज़िटिव कोशिकाएँ ÷ विश्लेषित टिशू क्षेत्रफलक्षेत्रों के बीच घुसपैठ करने वाली या बिखरी हुई कोशिकाओं की तुलना, जैसे इम्यून कोशिकाएँ

नतीजे देखने से पहले माप चुनें, और हर सैंपल के लिए वही माप इस्तेमाल करें। गिनती पर आधारित इंडेक्स के लिए Ki-67 इंडेक्स कैलकुलेटर दिखाता है कि किसी दिए गए आकार की गिनती कितनी ग़लत हो सकती है।

IHC क्वांटिफ़िकेशन के लिए सॉफ़्टवेयर

टूललागतप्लैटफ़ॉर्मIHC के लिए यह क्या करता है
QuPathमुफ़्त, ओपन सोर्सWindows, macOS, Linuxहोल स्लाइड पर कोशिका पहचान; एक थ्रेशोल्ड से Positive % और तीन से H-score; बैच के लिए स्क्रिप्ट
Fiji / ImageJमुफ़्त, ओपन सोर्सWindows, macOS, LinuxColour Deconvolution स्टेन अलग करता है; थ्रेशोल्डिंग, एरिया फ़्रैक्शन और कणों की गिनती मैनुअल चरण हैं या मैक्रो से होती हैं
SlideScopeपेड; अपनी इमेज स्कोर करने के लिए सदस्यता ज़रूरी हैWindows 10/11, macOS 14+किसी क्षेत्र की बिना कोड स्कोरिंग: न्यूक्लियर DAB मार्कर के लिए पॉज़िटिव प्रतिशत, H-score और Allred स्कोर, या सामान्य भाषा में पूछकर
HALO, Visiopharmव्यावसायिक, लाइसेंस कोटेशन परWindowsअधिक मात्रा में काम करने वाली और विनियमित (regulated) प्रयोगशालाओं के लिए बने IHC विश्लेषण मॉड्यूल

विश्लेषण टूल की व्यापक तुलना माइक्रोस्कोपी इमेज विश्लेषण सॉफ़्टवेयर की तुलना पर है।

QuPath में IHC कैसे मापें

  1. स्लाइड खोलें और इमेज टाइप Brightfield (H-DAB) पर सेट करें, ताकि QuPath हेमाटॉक्सिलिन को DAB से अलग करे।
  2. स्कोर करने वाले टिशू के चारों ओर एक एनोटेशन बनाएँ। पूरी इमेज स्कोर करने से बचें: फ़ोल्ड, किनारे और बैकग्राउंड नतीजे को बिगाड़ देते हैं।
  3. एनोटेशन पर Analyze › Cell detection › Positive cell detection चलाएँ। जाँचें कि पहचाने गए न्यूक्लियस इमेज से मेल खाते हैं, और अगर न्यूक्लियस आपस में जुड़ गए हों या छूट गए हों तो डिटेक्शन सेटिंग्स बदलें।
  4. न्यूक्लियर मार्कर के लिए Score compartment को Nucleus: DAB OD mean पर सेट करें। एक थ्रेशोल्ड कोशिकाओं को पॉज़िटिव और नेगेटिव में बाँटता है; अधिकतम तीन थ्रेशोल्ड उन्हें कमज़ोर, मध्यम और तीव्र (1+, 2+, 3+) में ग्रेड करते हैं।
  5. Annotations टैब में एनोटेशन के लिए Positive % पढ़ें। तीन थ्रेशोल्ड होने पर QuPath 0 से 300 तक का H-score भी निकालता है।
  6. Measure › Show annotation measurements खोलें, अपने सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए तालिका को CSV में एक्सपोर्ट करें, और अपने methods में थ्रेशोल्ड दर्ज करें।

यही तीव्रता थ्रेशोल्ड बाद में Classify › Object classification › Set cell intensity classifications से बदले जा सकते हैं, कोशिकाओं को दोबारा पहचाने बिना।

Fiji (ImageJ) में DAB स्टेनिंग कैसे मापें

  1. ब्राइटफ़ील्ड RGB इमेज खोलें। होल स्लाइड आमतौर पर पूरे रिज़ॉल्यूशन पर खोलने के लिए बहुत बड़ी होती है, इसलिए पहले उसका कोई क्षेत्र या फ़ील्ड एक्सपोर्ट करें।
  2. Image › Color › Colour Deconvolution चलाएँ और H DAB वेक्टर चुनें। आपको तीन इमेज मिलती हैं: हेमाटॉक्सिलिन, DAB और एक रेज़िडुअल।
  3. स्टेन हुए क्षेत्रफल के लिए: DAB इमेज पर Image › Adjust › Threshold से थ्रेशोल्ड सेट करें, Analyze › Set Measurements में Area fraction और Limit to threshold पर टिक करें, फिर Analyze › Measure चलाएँ।
  4. पॉज़िटिव कोशिकाओं के प्रतिशत के लिए: हेमाटॉक्सिलिन और DAB इमेज पर न्यूक्लियस गिनें (थ्रेशोल्ड, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), फिर पॉज़िटिव न्यूक्लियस को सभी न्यूक्लियस से भाग दें।
  5. हर इमेज के लिए वही थ्रेशोल्ड मान इस्तेमाल करें, और चरणों को मैक्रो के रूप में रिकॉर्ड करें ताकि बैच दोहराया जा सके।

प्लगइन के लेखक चेतावनी देते हैं कि DAB के गहरेपन को एंटीजन की मात्रा न समझें: DAB Beer-Lambert नियम का पालन नहीं करता, और इम्यूनोस्टेनिंग स्टॉइकियोमेट्रिक नहीं है। तीव्रता की तुलना केवल एक ही स्टेनिंग रन के भीतर करें, और कच्चे गहरेपन की तुलना के बजाय पॉज़िटिव कोशिकाएँ गिनने या क्षेत्रफल मापने को प्राथमिकता दें।

SlideScope में IHC कैसे स्कोर करें (बिना कोड)

  1. Windows या Mac पर SlideScope में स्लाइड खोलें (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF और अन्य फ़ॉर्मैट जिन्हें यह पढ़ता है) और स्कोर करने वाला क्षेत्र बनाएँ या उस पर ज़ूम करें।
  2. Quantify खोलें, Objects को न्यूक्लियस (nuclei) पर और Stains को Hematoxylin + DAB (IHC) पर सेट करें। अगर आपके स्टेन के रंग डिफ़ॉल्ट से अलग हैं, तो स्लाइड से स्टेन वेक्टर का अनुमान लगाएँ।
  3. Marker classification के अंतर्गत, DAB को पॉज़िटिव मार्कर रखकर Classify marker-positive objects चालू करें। तीन ग्रेड थ्रेशोल्ड (1+, 2+, 3+, ऑप्टिकल डेंसिटी में) 0.2, 0.4 और 0.6 से शुरू होते हैं और बदले जा सकते हैं।
  4. इसे चलाएँ। हर न्यूक्लियस इमेज पर आउटलाइन होता है, इसलिए आप नतीजा जाँच सकते हैं, किसी न्यूक्लियस का वर्ग सुधार सकते हैं या ग़लत पढ़ी गई किसी भी चीज़ को बाहर कर सकते हैं।
  5. क्षेत्र के लिए पॉज़िटिव प्रतिशत, H-score, Allred स्कोर और प्रति mm² पॉज़िटिव कोशिकाएँ पढ़ें, फिर ऑब्जेक्ट तालिका (CSV), आउटलाइन (GeoJSON, जिसे QuPath खोलता है) और methods सारांश एक्सपोर्ट करें।

या सवाल टाइप करें। Ask Your Slide से आप पूछ सकते हैं “इस क्षेत्र में कितने प्रतिशत न्यूक्लियस Ki67-पॉज़िटिव हैं?” या “मेरे आउटलाइन किए गए क्षेत्र का H-score और Allred स्कोर बताइए”, और SlideScope आपके कंप्यूटर पर यही टूल चलाता है और हर संख्या का साक्ष्य दिखाता है। स्कोर QuPath जैसी ही परिभाषाओं का उपयोग करते हैं, इसलिए एक ही कोशिकाओं पर दोनों के नतीजे मेल खाते हैं। स्कोरिंग न्यूक्लियस को ग्रेड करती है, जो न्यूक्लियर मार्कर के लिए उपयुक्त है; नतीजे रिसर्च उपयोग के लिए हैं और उन्हें आपकी विज़ुअल जाँच चाहिए। ज़्यादा जानकारी गणना वाले पेज पर।

संख्या सही है या नहीं, यह किन बातों से तय होता है

  • मार्कर कहाँ स्थित है: न्यूक्लियस-आधारित स्कोरिंग Ki-67, ER, PR और p53 जैसे न्यूक्लियर मार्कर के लिए उपयुक्त है। मेम्ब्रेन मार्कर (HER2, PD-L1) और साइटोप्लाज़्मिक मार्कर के लिए स्टेन को उसी कंपार्टमेंट में मापना ज़रूरी है, और उनकी क्लिनिकल स्कोरिंग एसे के अपने मैनुअल के अनुसार होती है।
  • कंट्रोल पर तय थ्रेशोल्ड: प्रयोग को स्कोर करने से पहले, उसी स्टेनिंग रन के कंट्रोल टिशू पर पॉज़िटिव थ्रेशोल्ड तय करें, और उसे कभी भी हर स्लाइड के हिसाब से न बदलें।
  • क्षेत्र: उसी टिशू को स्कोर करें जिसके बारे में सवाल है, और नेक्रोसिस, फ़ोल्ड, किनारे की स्टेनिंग और स्ट्रोमा को बाहर रखें, जब तक प्रोटोकॉल उन्हें शामिल न करता हो। हॉट स्पॉट और पूरे सेक्शन अलग-अलग संख्याएँ देते हैं; बताएँ कि आपने कौन-सा इस्तेमाल किया।
  • पहचान जाँचें: आउटलाइन देखें। आपस में जुड़े न्यूक्लियस गिनती घटाते हैं और टूटे हुए न्यूक्लियस उसे बढ़ाते हैं; घने टिशू के लिए डीप-लर्निंग डिटेक्टर या बदली हुई सेटिंग्स चाहिए।
  • पर्याप्त कोशिकाएँ, सही n: हर सैंपल में कई सौ कोशिकाएँ स्कोर करें, और आँकड़ों का विश्लेषण हर जानवर या मरीज़ के एक मान पर करें, कोशिकाओं या फ़ील्ड पर नहीं।
  • इसे रिपोर्ट करें: सॉफ़्टवेयर और संस्करण, स्टेन वेक्टर, थ्रेशोल्ड, क्षेत्र चुनने का नियम, गिनी गई कोशिकाएँ और नतीजे की जाँच किसने की।

प्रश्न

IHC स्टेनिंग को कैसे मापें?

तय करें कि क्या मापना है (पॉज़िटिव कोशिकाओं का प्रतिशत, H-score, Allred स्कोर या स्टेन हुआ क्षेत्रफल), स्कोर करने वाले क्षेत्र की आउटलाइन बनाएँ, कलर डीकॉन्वोल्यूशन से DAB स्टेन को हेमाटॉक्सिलिन से अलग करें, कोशिकाओं का पता लगाएँ, हर एक को तय थ्रेशोल्ड के आधार पर ग्रेड करें, और थ्रेशोल्ड तथा कोशिकाओं की संख्या के साथ स्कोर रिपोर्ट करें।

IHC क्वांटिफ़िकेशन के लिए कौन-सा सॉफ़्टवेयर इस्तेमाल होता है?

QuPath और Fiji (ImageJ) मुफ़्त हैं और व्यापक रूप से इस्तेमाल होते हैं। QuPath होल स्लाइड पर कोशिकाओं का पता लगाता है और पॉज़िटिव प्रतिशत व H-score बताता है; Fiji स्टेन अलग करता है और गिनती के चरण आप पर छोड़ता है। SlideScope बिना कोड के किसी क्षेत्र को स्कोर करता है, और HALO व Visiopharm जैसे व्यावसायिक प्लेटफ़ॉर्म IHC मॉड्यूल बेचते हैं।

पॉज़िटिव प्रतिशत बेहतर है या H-score?

पॉज़िटिव प्रतिशत बताता है कि कितनी कोशिकाएँ मार्कर व्यक्त करती हैं, और इसे दोहराना आसान है। H-score यह भी तौलता है कि वे कितनी तीव्रता से स्टेन होती हैं, जो तीव्रता बदलने पर मदद करता है, लेकिन यह तीन थ्रेशोल्ड पर निर्भर करता है। दोनों स्थितियों में पॉज़िटिव प्रतिशत रिपोर्ट करें।

क्या ImageJ DAB की तीव्रता माप सकता है?

यह माप सकता है कि अलग की गई DAB इमेज कितनी गहरी है, लेकिन DAB Beer-Lambert नियम का पालन नहीं करता और इम्यूनोस्टेनिंग स्टॉइकियोमेट्रिक नहीं है, इसलिए गहरापन एंटीजन की मात्रा का माप नहीं है। कच्चे गहरेपन की तुलना के बजाय पॉज़िटिव कोशिकाएँ गिनना, या स्टेन हुआ क्षेत्रफल मापना, ज़्यादा तर्कसंगत है।

मुझे कितने फ़ील्ड या कोशिकाएँ स्कोर करनी चाहिए?

इतनी कि टिशू का प्रतिनिधित्व हो सके: हर सैंपल में कम से कम कई सौ कोशिकाएँ, ऐसे फ़ील्ड से जिन्हें स्टेनिंग देखने से पहले तय किए गए नियम से चुना गया हो। आँकड़ों की इकाई जानवर या मरीज़ है, कोशिका नहीं।

क्या SlideScope IHC को मापता है?

हाँ, न्यूक्लियर DAB मार्कर के लिए। यह आपके चुने हुए क्षेत्र में न्यूक्लियस गिनता है, हर एक को उसकी औसत DAB ऑप्टिकल डेंसिटी से ग्रेड करता है, और आपके अपने कंप्यूटर पर पॉज़िटिव प्रतिशत, H-score और Allred स्कोर बताता है। यह एक पेड ऐप है जिसके साथ मुफ़्त सैंपल लाइब्रेरी (हर टूल के साथ) मिलती है, और आपकी अपनी इमेज के लिए सदस्यता ज़रूरी है। केवल रिसर्च उपयोग के लिए।

स्रोत

यह गाइड रिसर्च और शिक्षण के लिए है। यह निदान की प्रक्रिया नहीं है: मरीज़ की देखभाल के लिए स्कोरिंग मान्य (validated) एसे, उस मार्कर की मौजूदा गाइडलाइन और पैथोलॉजिस्ट के निर्णय के अनुसार होती है।

अपनी स्लाइड पर IHC स्कोर करें

SlideScope आपके अपने कंप्यूटर पर आपकी स्लाइड के किसी क्षेत्र को स्कोर करता है और हर संख्या के पीछे की आउटलाइन दिखाता है। बिल्ट-इन सैंपल पर हर टूल मुफ़्त में आज़माएँ; अपनी इमेज खोलने के लिए सदस्यता ज़रूरी है। पहले ही तय कर चुके हैं? अभी सब्सक्राइब करें।

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