Como quantificar a coloração de IHQ

Decida o que medir

Escolha a medida antes de olhar os resultados e use a mesma em todas as amostras. Para um índice baseado em contagens, a calculadora do índice Ki-67 mostra quanto uma contagem de determinado tamanho pode se desviar.

Software para quantificação de IHQ

Uma comparação mais ampla de ferramentas de análise está em comparação de softwares de análise de imagens de microscopia.

Como quantificar IHQ no QuPath

1. Abra a lâmina e defina o tipo de imagem como Brightfield (H-DAB), para que o QuPath separe a hematoxilina da DAB.
2. Desenhe uma anotação ao redor do tecido a pontuar. Evite pontuar a imagem inteira: dobras, bordas e fundo distorcem o resultado.
3. Execute Analyze › Cell detection › Positive cell detection na anotação. Confira se os núcleos detectados correspondem à imagem e ajuste as configurações de detecção se houver núcleos fundidos ou não detectados.
4. Para um marcador nuclear, defina Score compartment como Nucleus: DAB OD mean. Um único limiar divide as células em positivas e negativas; até três limiares as graduam como fracas, moderadas e fortes (1+, 2+, 3+).
5. Leia a Positive % da anotação na aba Annotations. Com três limiares, o QuPath também calcula o H-score, de 0 a 300.
6. Abra Measure › Show annotation measurements, exporte a tabela para CSV para a sua estatística e registre os limiares nos seus métodos.

Os mesmos limiares de intensidade podem ser alterados depois com Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, sem detectar as células de novo.

Como quantificar a coloração de DAB no Fiji (ImageJ)

1. Abra a imagem RGB de campo claro. Uma lâmina inteira geralmente é grande demais para abrir em resolução total, então exporte primeiro uma região ou um campo.
2. Execute Image › Color › Colour Deconvolution e escolha os vetores H DAB. Você obtém três imagens: hematoxilina, DAB e um resíduo.
3. Para a área corada: na imagem de DAB, defina um limiar com Image › Adjust › Threshold, marque Area fraction e Limit to threshold em Analyze › Set Measurements e depois execute Analyze › Measure.
4. Para a porcentagem de células positivas: conte os núcleos nas imagens de hematoxilina e de DAB (limiar, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles) e depois divida os núcleos positivos por todos os núcleos.
5. Use os mesmos valores de limiar em todas as imagens e grave as etapas como macro para que o lote seja reprodutível.

O autor do plugin alerta contra ler o escurecimento da DAB como uma quantidade de antígeno: a DAB não segue a lei de Beer-Lambert e a imunomarcação não é estequiométrica. Compare a intensidade apenas dentro de uma mesma rodada de coloração e, em vez de comparar o escurecimento bruto, prefira contar células positivas ou medir a área.

Como pontuar IHQ no SlideScope (sem programação)

1. Abra a lâmina no SlideScope no Windows ou no Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF e os outros formatos que ele lê) e desenhe a região a pontuar ou dê zoom até ela.
2. Abra Quantify, defina Objects como núcleos e Stains como Hematoxylin + DAB (IHC). Se as cores da sua coloração forem diferentes das padrão, estime os vetores de coloração a partir da lâmina.
3. Em Marker classification, ative Classify marker-positive objects com a DAB como marcador positivo. Os três limiares de grau (1+, 2+, 3+, em densidade óptica) começam em 0,2, 0,4 e 0,6 e podem ser editados.
4. Execute. Cada núcleo fica contornado na imagem, para que você possa conferir o resultado, corrigir a classe de um núcleo ou excluir o que tiver sido mal interpretado.
5. Leia a porcentagem de positivos, o H-score, o escore de Allred e as células positivas por mm² da região e depois exporte a tabela de objetos (CSV), os contornos (GeoJSON, que o QuPath abre) e um resumo dos métodos.

Ou digite a pergunta. Com o Ask Your Slide você pode perguntar “qual porcentagem de núcleos é Ki67-positiva nesta região?” ou “me dê o H-score e o escore de Allred da área que eu delimitei”, e o SlideScope executa essas mesmas ferramentas no seu computador e mostra as evidências de cada número. Os escores usam as mesmas definições do QuPath, então os dois concordam nas mesmas células. A pontuação gradua núcleos, o que é adequado para marcadores nucleares; os resultados são para uso em pesquisa e precisam da sua conferência visual. Mais detalhes na página de contagem.

O que decide se o número está certo

• Onde o marcador fica: a pontuação baseada no núcleo é adequada para marcadores nucleares como Ki-67, RE, RP e p53. Marcadores de membrana (HER2, PD-L1) e citoplasmáticos exigem que a coloração seja medida nesse compartimento, e a pontuação clínica deles segue o manual do próprio ensaio.
• Limiares definidos em controles: fixe o limiar de positividade em tecido controle da mesma rodada de coloração, antes de pontuar o experimento, e nunca o ajuste lâmina a lâmina.
• A região: pontue o tecido de que trata a pergunta e deixe de fora necrose, dobras, coloração de borda e estroma, a menos que o protocolo os inclua. Hot spots e cortes inteiros dão números diferentes; informe qual você usou.
• Confira a detecção: olhe os contornos. Núcleos fundidos reduzem a contagem e núcleos divididos a aumentam; tecido muito denso precisa de um detector de aprendizado profundo ou de configurações ajustadas.
• Células suficientes, o n certo: pontue várias centenas de células por amostra e faça a estatística com um valor por animal ou paciente, não por célula ou campo.
• Relate: software e versão, vetores de coloração, limiares, a regra de escolha da região, células contadas e quem conferiu o resultado.

Perguntas

Fontes

• Documentação do QuPath: detecção de células, Positive cell detection e Score compartment
• Documentação do QuPath: classificação celular, limiares de intensidade, Positive % e H-score
• Documentação do ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: os vetores H DAB e por que o escurecimento da DAB não é uma medida de antígeno
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Este guia é para pesquisa e ensino. Não é um procedimento diagnóstico: a pontuação para o cuidado do paciente segue o ensaio validado, a diretriz vigente para aquele marcador e o julgamento de um patologista.