Cách định lượng nhuộm IHC

Quyết định đo cái gì

Hãy chọn chỉ số đo trước khi xem kết quả, và dùng cùng một chỉ số cho mọi mẫu. Với chỉ số dựa trên số đếm, công cụ tính chỉ số Ki-67 cho thấy một số đếm với cỡ nhất định có thể lệch bao xa.

Phần mềm định lượng IHC

Bảng so sánh rộng hơn về các công cụ phân tích có tại so sánh phần mềm phân tích ảnh hiển vi.

Cách định lượng IHC trong QuPath

1. Mở tiêu bản và đặt loại ảnh là Brightfield (H-DAB), để QuPath tách hematoxylin khỏi DAB.
2. Vẽ một chú thích (annotation) bao quanh vùng mô cần chấm điểm. Tránh chấm điểm toàn bộ ảnh: nếp gấp, rìa và nền sẽ làm sai lệch kết quả.
3. Chạy Analyze › Cell detection › Positive cell detection trên chú thích đó. Kiểm tra xem các nhân được phát hiện có khớp với ảnh không, và điều chỉnh thiết lập phát hiện nếu có nhân bị gộp hoặc bị bỏ sót.
4. Với chất đánh dấu nhân, đặt Score compartment thành Nucleus: DAB OD mean. Một ngưỡng duy nhất chia tế bào thành dương tính và âm tính; tối đa ba ngưỡng phân mức chúng thành yếu, vừa và mạnh (1+, 2+, 3+).
5. Đọc Positive % của chú thích trong thẻ Annotations. Với ba ngưỡng, QuPath còn tính H-score, từ 0 đến 300.
6. Mở Measure › Show annotation measurements, xuất bảng sang CSV cho phần thống kê, và ghi lại các ngưỡng trong phần phương pháp.

Có thể thay đổi các ngưỡng cường độ đó sau này bằng Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, mà không cần phát hiện lại tế bào.

Cách định lượng nhuộm DAB trong Fiji (ImageJ)

1. Mở ảnh RGB trường sáng. Một ảnh toàn tiêu bản thường quá lớn để mở ở độ phân giải đầy đủ, vì vậy hãy xuất một vùng hoặc vi trường từ ảnh đó trước.
2. Chạy Image › Color › Colour Deconvolution và chọn vector H DAB. Bạn sẽ có ba ảnh: hematoxylin, DAB và phần dư.
3. Để đo diện tích bắt màu: trên ảnh DAB, đặt ngưỡng bằng Image › Adjust › Threshold, đánh dấu Area fraction và Limit to threshold trong Analyze › Set Measurements, rồi chạy Analyze › Measure.
4. Để tính phần trăm tế bào dương tính: đếm nhân trên ảnh hematoxylin và ảnh DAB (phân ngưỡng, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), rồi chia số nhân dương tính cho tổng số nhân.
5. Dùng cùng giá trị ngưỡng cho mọi ảnh, và ghi lại các bước thành macro để lô xử lý có thể lặp lại.

Tác giả của plugin cảnh báo không nên coi độ đậm của DAB là lượng kháng nguyên: DAB không tuân theo định luật Beer-Lambert, và nhuộm miễn dịch không theo tỷ lượng. Chỉ so sánh cường độ trong cùng một mẻ nhuộm, và ưu tiên đếm tế bào dương tính hoặc đo diện tích thay vì so sánh độ đậm thô.

Cách chấm điểm IHC trong SlideScope (không cần mã)

1. Mở tiêu bản trong SlideScope trên Windows hoặc Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF và các định dạng khác mà ứng dụng đọc được), rồi vẽ hoặc phóng to tới vùng cần chấm điểm.
2. Mở Quantify, đặt Objects là nhân (nuclei) và Stains là Hematoxylin + DAB (IHC). Nếu màu chất nhuộm của bạn khác với mặc định, hãy ước lượng các vector nhuộm từ chính tiêu bản.
3. Trong Marker classification, bật Classify marker-positive objects với DAB là chất đánh dấu dương tính. Ba ngưỡng phân mức (1+, 2+, 3+, tính theo mật độ quang) bắt đầu ở 0,2, 0,4 và 0,6 và có thể chỉnh sửa.
4. Chạy phân tích. Mỗi nhân được viền trên ảnh, nên bạn có thể kiểm tra kết quả, sửa lớp của một nhân hoặc loại bỏ bất cứ thứ gì bị đọc sai.
5. Đọc phần trăm dương tính, H-score, điểm Allred và số tế bào dương tính trên mỗi mm² cho vùng đó, rồi xuất bảng đối tượng (CSV), đường viền (GeoJSON, mở được trong QuPath) và bản tóm tắt phương pháp.

Hoặc gõ câu hỏi. Với Ask Your Slide, bạn có thể hỏi “bao nhiêu phần trăm nhân dương tính Ki67 trong vùng này?” hoặc “cho tôi H-score và điểm Allred của vùng tôi đã khoanh”, và SlideScope chạy chính các công cụ đó trên máy tính của bạn, kèm bằng chứng cho mọi con số. Các điểm số dùng cùng định nghĩa với QuPath, nên hai phần mềm cho kết quả khớp nhau trên cùng các tế bào. Việc chấm điểm phân mức các nhân, nên phù hợp với chất đánh dấu nhân; kết quả chỉ dùng cho nghiên cứu và cần bạn kiểm tra bằng mắt. Xem thêm tại trang đếm.

Điều gì quyết định con số có đúng hay không

• Vị trí của chất đánh dấu: chấm điểm dựa trên nhân phù hợp với các chất đánh dấu nhân như Ki-67, ER, PR và p53. Chất đánh dấu màng (HER2, PD-L1) và chất đánh dấu bào tương cần đo mức nhuộm ở đúng ngăn đó, và việc chấm điểm lâm sàng cho chúng tuân theo tài liệu hướng dẫn riêng của xét nghiệm.
• Ngưỡng đặt trên mẫu chứng: cố định ngưỡng dương tính trên mô chứng thuộc cùng mẻ nhuộm, trước khi chấm điểm thí nghiệm, và không bao giờ điều chỉnh theo từng tiêu bản.
• Vùng chấm điểm: chấm điểm phần mô mà câu hỏi nghiên cứu quan tâm, và loại trừ hoại tử, nếp gấp, nhuộm ở rìa và mô đệm trừ khi quy trình có bao gồm. Điểm nóng và toàn bộ lát cắt cho ra những con số khác nhau; hãy nêu rõ bạn đã dùng cách nào.
• Kiểm tra kết quả phát hiện: hãy xem các đường viền. Nhân bị gộp làm giảm số đếm và nhân bị tách làm tăng số đếm; mô dày đặc cần một bộ phát hiện học sâu hoặc thiết lập đã điều chỉnh.
• Đủ tế bào, đúng n: chấm điểm vài trăm tế bào cho mỗi mẫu, và làm thống kê trên một giá trị cho mỗi con vật hoặc mỗi bệnh nhân, không phải trên từng tế bào hay từng vi trường.
• Báo cáo đầy đủ: phần mềm và phiên bản, vector nhuộm, các ngưỡng, quy tắc chọn vùng, số tế bào đã đếm và người đã kiểm tra kết quả.

Câu hỏi

Nguồn

• Tài liệu QuPath: phát hiện tế bào, Positive cell detection và Score compartment
• Tài liệu QuPath: phân loại tế bào, ngưỡng cường độ, Positive % và H-score
• Tài liệu ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: vector H DAB, và vì sao độ đậm của DAB không phải là thước đo kháng nguyên
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Hướng dẫn này dành cho nghiên cứu và giảng dạy. Đây không phải là một quy trình chẩn đoán: việc chấm điểm phục vụ chăm sóc bệnh nhân phải tuân theo xét nghiệm đã được thẩm định, hướng dẫn hiện hành cho chất đánh dấu đó và nhận định của bác sĩ giải phẫu bệnh.