Как количественно оценить ИГХ-окрашивание

Решите, что измерять

Выберите показатель до того, как посмотрите на результаты, и используйте один и тот же для всех образцов. Для индекса на основе подсчёта калькулятор индекса Ki-67 показывает, насколько может ошибаться подсчёт заданного размера.

Программы для количественной оценки ИГХ

Более широкое сравнение программ анализа приведено на странице сравнение программ для анализа микроскопических изображений.

Как количественно оценить ИГХ в QuPath

1. Откройте слайд и задайте тип изображения Brightfield (H-DAB), чтобы QuPath отделил гематоксилин от DAB.
2. Нарисуйте аннотацию вокруг ткани, которую нужно оценить. Не оценивайте изображение целиком: складки, края и фон искажают результат.
3. Запустите Analyze › Cell detection › Positive cell detection для аннотации. Проверьте, что найденные ядра соответствуют изображению, и скорректируйте параметры обнаружения, если ядра слились или пропущены.
4. Для ядерного маркера задайте для Score compartment значение Nucleus: DAB OD mean. Один порог делит клетки на положительные и отрицательные; до трёх порогов делят их на слабые, умеренные и сильные (1+, 2+, 3+).
5. Прочитайте Positive % для аннотации на вкладке Annotations. С тремя порогами QuPath также рассчитывает H-score от 0 до 300.
6. Откройте Measure › Show annotation measurements, экспортируйте таблицу в CSV для статистической обработки и укажите пороги в разделе методов.

Те же пороги интенсивности можно изменить позже через Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, не обнаруживая клетки заново.

Как количественно оценить окрашивание DAB в Fiji (ImageJ)

1. Откройте RGB-изображение, снятое в светлом поле. Целый слайд обычно слишком велик, чтобы открыть его в полном разрешении, поэтому сначала экспортируйте из него область или поле.
2. Запустите Image › Color › Colour Deconvolution и выберите векторы H DAB. Получится три изображения: гематоксилин, DAB и остаток.
3. Для окрашенной площади: на изображении DAB задайте порог через Image › Adjust › Threshold, отметьте Area fraction и Limit to threshold в Analyze › Set Measurements, затем выполните Analyze › Measure.
4. Для процента положительных клеток: подсчитайте ядра на изображениях гематоксилина и DAB (порог, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), затем разделите число положительных ядер на число всех ядер.
5. Используйте одинаковые значения порога для всех изображений и запишите шаги в макрос, чтобы обработку серии можно было повторить.

Автор плагина предостерегает от того, чтобы считать темноту DAB мерой количества антигена: DAB не подчиняется закону Бера — Ламберта, а иммуноокрашивание не стехиометрично. Сравнивайте интенсивность только в пределах одной серии окрашивания и предпочитайте подсчёт положительных клеток или измерение площади сравнению «сырой» темноты.

Как оценить ИГХ в SlideScope (без кода)

1. Откройте слайд в SlideScope в Windows или на Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF и другие поддерживаемые форматы) и нарисуйте область для оценки или приблизьте её.
2. Откройте Quantify, выберите в Objects ядра, а в Stains — Hematoxylin + DAB (IHC). Если цвета вашего окрашивания отличаются от стандартных, оцените векторы красителей по слайду.
3. В разделе Marker classification включите Classify marker-positive objects и выберите DAB как положительный маркер. Три порога степеней (1+, 2+, 3+, в единицах оптической плотности) по умолчанию равны 0,2, 0,4 и 0,6 и могут быть изменены.
4. Запустите анализ. Каждое ядро обводится на изображении, поэтому вы можете проверить результат, исправить класс ядра или исключить то, что распознано неверно.
5. Прочитайте для области процент положительных клеток, H-score, балл Allred и число положительных клеток на мм², затем экспортируйте таблицу объектов (CSV), контуры (GeoJSON, который открывает QuPath) и сводку методов.

Или задайте вопрос. С Ask Your Slide можно спросить: «Какой процент ядер в этой области Ki67-положителен?» или «Дай H-score и балл Allred для обведённой области», и SlideScope выполнит эти же инструменты на вашем компьютере и покажет доказательства для каждого числа. Баллы используют те же определения, что и QuPath, поэтому на одних и тех же клетках результаты совпадают. Оценка присваивает степени ядрам, что подходит для ядерных маркеров; результаты предназначены для исследований и требуют вашей визуальной проверки. Подробнее на странице подсчёта.

От чего зависит, верно ли число

• Где находится маркер: оценка по ядрам подходит для ядерных маркеров, таких как Ki-67, ER, PR и p53. Для мембранных (HER2, PD-L1) и цитоплазматических маркеров окрашивание нужно измерять в соответствующем компартменте, а их клиническая оценка следует руководству к самому тесту.
• Пороги задаются на контролях: зафиксируйте порог положительности на контрольной ткани из той же серии окрашивания до оценки эксперимента и никогда не подстраивайте его под отдельный слайд.
• Область: оценивайте ту ткань, к которой относится вопрос, и исключайте некроз, складки, краевое окрашивание и строму, если протокол их не включает. Горячие точки и целые срезы дают разные числа; укажите, что вы использовали.
• Проверяйте обнаружение: смотрите на контуры. Слившиеся ядра занижают подсчёт, а разделённые — завышают; для плотной ткани нужен детектор на основе глубокого обучения или скорректированные параметры.
• Достаточно клеток и правильное n: оценивайте несколько сотен клеток на образец, а статистику проводите по одному значению на животное или пациента, а не по клеткам или полям.
• Указывайте в отчёте: программу и её версию, векторы красителей, пороги, правило выбора области, число подсчитанных клеток и кто проверял результат.

Вопросы

Источники

• Документация QuPath: обнаружение клеток, Positive cell detection и Score compartment
• Документация QuPath: классификация клеток, пороги интенсивности, Positive % и H-score
• Документация ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: векторы H DAB и почему темнота DAB не является мерой количества антигена
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Это руководство предназначено для исследований и обучения. Оно не является диагностической процедурой: оценка для лечения пациентов основывается на валидированном тесте, действующих рекомендациях для данного маркера и суждении патолога.