Comment quantifier un marquage IHC

Décider quoi mesurer

Choisissez la mesure avant de regarder les résultats, et utilisez la même pour chaque échantillon. Pour un index fondé sur un comptage, le calculateur de l’index Ki-67 montre de combien un comptage d’une taille donnée peut s’écarter.

Logiciels de quantification IHC

Une comparaison plus large des outils d’analyse figure dans le comparatif des logiciels d’analyse d’images de microscopie.

Comment quantifier l’IHC dans QuPath

1. Ouvrez la lame et réglez le type d’image sur Brightfield (H-DAB), afin que QuPath sépare l’hématoxyline du DAB.
2. Tracez une annotation autour du tissu à scorer. Évitez de scorer l’image entière : plis, bords et fond faussent le résultat.
3. Lancez Analyze › Cell detection › Positive cell detection sur l’annotation. Vérifiez que les noyaux détectés correspondent à l’image, et ajustez les paramètres de détection si des noyaux sont fusionnés ou manqués.
4. Pour un marqueur nucléaire, réglez Score compartment sur Nucleus: DAB OD mean. Un seul seuil sépare les cellules en positives et négatives ; jusqu’à trois seuils les classent en faibles, modérées et fortes (1+, 2+, 3+).
5. Lisez Positive % pour l’annotation dans l’onglet Annotations. Avec trois seuils, QuPath calcule aussi le H-score, de 0 à 300.
6. Ouvrez Measure › Show annotation measurements, exportez le tableau en CSV pour vos statistiques, et notez les seuils dans vos méthodes.

Les mêmes seuils d’intensité peuvent être modifiés après coup avec Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, sans relancer la détection des cellules.

Comment quantifier un marquage DAB dans Fiji (ImageJ)

1. Ouvrez l’image RGB en fond clair. Une lame entière est généralement trop grande pour être ouverte en pleine résolution : exportez-en d’abord une région ou un champ.
2. Lancez Image › Color › Colour Deconvolution et choisissez les vecteurs H DAB. Vous obtenez trois images : hématoxyline, DAB et un résidu.
3. Pour la surface marquée : sur l’image DAB, fixez un seuil avec Image › Adjust › Threshold, cochez Area fraction et Limit to threshold dans Analyze › Set Measurements, puis lancez Analyze › Measure.
4. Pour le pourcentage de cellules positives : comptez les noyaux sur les images hématoxyline et DAB (seuil, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), puis divisez les noyaux positifs par l’ensemble des noyaux.
5. Utilisez les mêmes valeurs de seuil pour chaque image, et enregistrez les étapes sous forme de macro pour que le traitement par lots soit reproductible.

L’auteur du plugin met en garde contre l’interprétation de l’intensité du DAB comme une quantité d’antigène : le DAB ne suit pas la loi de Beer-Lambert, et l’immunomarquage n’est pas stœchiométrique. Ne comparez l’intensité qu’au sein d’une même série de marquage, et préférez le comptage des cellules positives ou la mesure de surface à la comparaison de l’intensité brute.

Comment scorer l’IHC dans SlideScope (sans code)

1. Ouvrez la lame dans SlideScope sous Windows ou sur Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF et les autres formats qu’il lit), puis tracez la région à scorer ou zoomez dessus.
2. Ouvrez Quantify, réglez Objects sur les noyaux et Stains sur Hematoxylin + DAB (IHC). Si les couleurs de votre marquage diffèrent des valeurs par défaut, estimez les vecteurs de coloration à partir de la lame.
3. Dans Marker classification, activez Classify marker-positive objects avec le DAB comme marqueur positif. Les trois seuils de grade (1+, 2+, 3+, en densité optique) valent au départ 0,2 ; 0,4 et 0,6 et sont modifiables.
4. Lancez l’analyse. Chaque noyau est délimité sur l’image : vous pouvez vérifier le résultat, corriger la classe d’un noyau ou exclure tout ce qui a été mal interprété.
5. Lisez le pourcentage de positifs, le H-score, le score d’Allred et les cellules positives par mm² pour la région, puis exportez le tableau des objets (CSV), les contours (GeoJSON, que QuPath ouvre) et un résumé de méthodes.

Ou tapez la question. Avec Ask Your Slide, vous pouvez demander « quel pourcentage de noyaux est Ki67-positif dans cette région ? » ou « donne-moi le H-score et le score d’Allred de la zone que j’ai tracée », et SlideScope exécute ces mêmes outils sur votre ordinateur et montre les preuves de chaque nombre. Les scores utilisent les mêmes définitions que QuPath : les deux concordent donc sur les mêmes cellules. Le score classe les noyaux, ce qui convient aux marqueurs nucléaires ; les résultats sont destinés à un usage de recherche et nécessitent votre vérification visuelle. Plus de détails sur la page consacrée au comptage.

Ce qui détermine la justesse du nombre

• La localisation du marqueur : le score fondé sur les noyaux convient aux marqueurs nucléaires comme Ki-67, ER, PR et p53. Les marqueurs membranaires (HER2, PD-L1) et cytoplasmiques nécessitent de mesurer le marquage dans le compartiment concerné, et leur score clinique suit le manuel propre à la technique.
• Des seuils fixés sur des témoins : fixez le seuil de positivité sur un tissu témoin de la même série de marquage, avant de scorer l’expérience, et ne l’ajustez jamais lame par lame.
• La région : scorez le tissu sur lequel porte la question, et excluez la nécrose, les plis, le marquage des bords et le stroma, sauf si le protocole les inclut. Hot-spots et coupes entières donnent des nombres différents ; précisez ce que vous avez utilisé.
• Vérifiez la détection : regardez les contours. Les noyaux fusionnés font baisser le comptage et les noyaux scindés le font augmenter ; un tissu dense nécessite un détecteur par apprentissage profond ou des réglages adaptés.
• Assez de cellules, le bon n : scorez plusieurs centaines de cellules par échantillon, et faites les statistiques sur une valeur par animal ou par patient, pas sur les cellules ni les champs.
• Rapportez-le : logiciel et version, vecteurs de coloration, seuils, règle de choix de la région, cellules comptées et personne ayant vérifié le résultat.

Questions

Sources

• Documentation QuPath : détection des cellules, Positive cell detection et Score compartment
• Documentation QuPath : classification des cellules, seuils d’intensité, Positive % et H-score
• Documentation ImageJ : Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2 : les vecteurs H DAB, et pourquoi l’intensité du DAB n’est pas une mesure de l’antigène
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Ce guide est destiné à la recherche et à l’enseignement. Ce n’est pas une procédure diagnostique : le score destiné à la prise en charge des patients suit la technique validée, la recommandation en vigueur pour ce marqueur et le jugement d’un pathologiste.