Cara Mengkuantifikasi Pewarnaan IHC

Tentukan apa yang akan diukur

Pilih ukurannya sebelum Anda melihat hasilnya, dan gunakan ukuran yang sama untuk setiap sampel. Untuk indeks berbasis hitungan, kalkulator indeks Ki-67 menunjukkan seberapa jauh hitungan dengan ukuran tertentu dapat meleset.

Perangkat lunak untuk kuantifikasi IHC

Perbandingan alat analisis yang lebih luas ada di perbandingan perangkat lunak analisis citra mikroskopi.

Cara mengkuantifikasi IHC di QuPath

1. Buka slide dan atur jenis citra ke Brightfield (H-DAB), agar QuPath memisahkan hematoksilin dari DAB.
2. Gambar anotasi di sekeliling jaringan yang akan dinilai. Hindari menilai seluruh citra: lipatan, tepi, dan latar belakang mendistorsi hasil.
3. Jalankan Analyze › Cell detection › Positive cell detection pada anotasi. Periksa apakah inti yang terdeteksi sesuai dengan citra, dan sesuaikan pengaturan deteksi bila ada inti yang menyatu atau terlewat.
4. Untuk penanda inti, atur Score compartment ke Nucleus: DAB OD mean. Satu ambang membagi sel menjadi positif dan negatif; hingga tiga ambang memberi grade lemah, sedang, dan kuat (1+, 2+, 3+).
5. Baca Positive % untuk anotasi di tab Annotations. Dengan tiga ambang, QuPath juga menghitung H-score, dari 0 sampai 300.
6. Buka Measure › Show annotation measurements, ekspor tabelnya ke CSV untuk analisis statistik Anda, dan catat ambangnya di bagian metode.

Ambang intensitas yang sama dapat diubah kemudian dengan Classify › Object classification › Set cell intensity classifications, tanpa mendeteksi sel lagi.

Cara mengkuantifikasi pewarnaan DAB di Fiji (ImageJ)

1. Buka citra RGB brightfield. Whole slide biasanya terlalu besar untuk dibuka pada resolusi penuh, jadi ekspor dulu sebuah region atau bidang darinya.
2. Jalankan Image › Color › Colour Deconvolution dan pilih vektor H DAB. Anda mendapatkan tiga citra: hematoksilin, DAB, dan residu.
3. Untuk area terwarnai: pada citra DAB, atur threshold dengan Image › Adjust › Threshold, centang Area fraction dan Limit to threshold di Analyze › Set Measurements, lalu jalankan Analyze › Measure.
4. Untuk persen sel positif: hitung inti pada citra hematoksilin dan DAB (threshold, Process › Binary › Watershed, Analyze › Analyze Particles), lalu bagi inti positif dengan semua inti.
5. Gunakan nilai threshold yang sama untuk setiap citra, dan rekam langkah-langkahnya sebagai makro agar batch dapat diulang.

Penulis plugin ini memperingatkan agar kegelapan DAB tidak dibaca sebagai jumlah antigen: DAB tidak mengikuti hukum Beer-Lambert, dan imunopewarnaan tidak stoikiometris. Bandingkan intensitas hanya dalam satu run pewarnaan, dan utamakan menghitung sel positif atau mengukur area daripada membandingkan kegelapan mentah.

Cara menilai IHC di SlideScope (tanpa kode)

1. Buka slide di SlideScope pada Windows atau Mac (SVS, NDPI, MRXS, CZI, TIFF, dan format lain yang dapat dibacanya), lalu gambar atau perbesar region yang akan dinilai.
2. Buka Quantify, atur Objects ke inti sel (nuclei) dan Stains ke Hematoxylin + DAB (IHC). Bila warna pewarnaan Anda berbeda dari bawaan, estimasi vektor pewarnaan dari slide.
3. Di bawah Marker classification, aktifkan Classify marker-positive objects dengan DAB sebagai penanda positif. Tiga ambang grade (1+, 2+, 3+, dalam densitas optik) dimulai pada 0,2, 0,4, dan 0,6 dan dapat diubah.
4. Jalankan. Setiap inti diberi garis batas pada citra, sehingga Anda dapat memeriksa hasilnya, mengoreksi kelas sebuah inti, atau mengecualikan apa pun yang salah terbaca.
5. Baca persen positif, H-score, skor Allred, dan sel positif per mm² untuk region tersebut, lalu ekspor tabel objek (CSV), garis batas (GeoJSON, yang dapat dibuka QuPath), dan ringkasan metode.

Atau ketik pertanyaannya. Dengan Ask Your Slide Anda dapat bertanya “berapa persen inti yang Ki67-positif di region ini?” atau “berikan H-score dan skor Allred untuk area yang saya tandai”, dan SlideScope menjalankan alat yang sama ini di komputer Anda serta menampilkan bukti untuk setiap angka. Skornya menggunakan definisi yang sama dengan QuPath, sehingga keduanya sepakat pada sel yang sama. Skoring memberi grade pada inti, yang cocok untuk penanda inti; hasilnya untuk penggunaan riset dan memerlukan pemeriksaan visual Anda. Selengkapnya di halaman penghitungan.

Apa yang menentukan apakah angkanya benar

• Lokasi penanda: skoring berbasis inti cocok untuk penanda inti seperti Ki-67, ER, PR, dan p53. Penanda membran (HER2, PD-L1) dan penanda sitoplasma memerlukan pengukuran pewarnaan di kompartemen tersebut, dan skoring klinisnya mengikuti manual assay itu sendiri.
• Ambang ditetapkan pada kontrol: tetapkan ambang positif pada jaringan kontrol dari run pewarnaan yang sama, sebelum menilai eksperimen, dan jangan pernah menyesuaikannya per slide.
• Region: nilai jaringan yang menjadi pokok pertanyaan, dan kecualikan nekrosis, lipatan, pewarnaan tepi, dan stroma, kecuali protokol menyertakannya. Hot spot dan seluruh potongan memberikan angka yang berbeda; nyatakan mana yang Anda gunakan.
• Periksa deteksinya: lihat garis batasnya. Inti yang menyatu menurunkan hitungan dan inti yang terbelah menaikkannya; jaringan yang padat memerlukan detektor deep learning atau pengaturan yang disesuaikan.
• Sel yang cukup, n yang tepat: nilai beberapa ratus sel per sampel, dan jalankan statistik pada satu nilai per hewan atau pasien, bukan pada sel atau bidang.
• Laporkan: perangkat lunak dan versinya, vektor pewarnaan, ambang, aturan region, jumlah sel yang dihitung, dan siapa yang memeriksa hasilnya.

Pertanyaan

Sumber

• Dokumentasi QuPath: deteksi sel, Positive cell detection, dan Score compartment
• Dokumentasi QuPath: klasifikasi sel, ambang intensitas, Positive %, dan H-score
• Dokumentasi ImageJ: Colour Deconvolution (Ruifrok AC, Johnston DA. Quantification of histochemical staining by color deconvolution. Anal Quant Cytol Histol 2001;23:291-299)
• Landini G. Colour Deconvolution 2: vektor H DAB, dan mengapa kegelapan DAB bukan ukuran antigen
• Nielsen TO et al. Assessment of Ki67 in breast cancer: updated recommendations from the International Ki67 in Breast Cancer Working Group. J Natl Cancer Inst 2021
• Wen Z et al. Deep learning-based H-score quantification of immunohistochemistry-stained images. Mod Pathol 2023

Panduan ini untuk riset dan pengajaran. Panduan ini bukan prosedur diagnostik: skoring untuk perawatan pasien mengikuti assay yang tervalidasi, pedoman terkini untuk penanda tersebut, dan penilaian seorang patolog.