Hücre kültürü
Hücre ekim hesaplayıcısı
Plakayı veya flaskı seçin, hücre konsantrasyonunuzu ve ekim yoğunluğunu girin; kuyucuk başına hücre sayısını, ne kadar hücre süspansiyonu ve besiyeri karıştırmanız gerektiğini ve her kuyucuğa ne konacağını öğrenin. Yaygın kaplar için büyüme alanları önceden doldurulmuştur ve düzenlenebilir; çünkü üreticiler arasında biraz farklılık gösterirler.
Ekim hesabı nasıl çalışır?
kuyucuk başına hücre = yoğunluk × alan · süspansiyon = kuyucuk başına hücre × kuyucuk sayısı ÷ konsantrasyon · besiyeri = kuyucuk başına hacim × kuyucuk sayısı − süspansiyon
Çözümlü örnek: 96 kuyucuklu bir plakaya, 1 × 10⁶ hücre/mL’lik bir süspansiyondan, kuyucuk başına 100 µL ve %10 fazlayla 20.000 hücre/cm² yoğunlukta ekim. Her kuyucuk 0,32 cm² olduğundan kuyucuk başına 6.400 hücre düşer. 96 kuyucuk × 1,1 = 105,6 kuyucukluk miktar: 675.840 hücre, yani 0,676 mL süspansiyon. Toplam hacim 10,56 mL olduğundan 9,88 mL besiyeri ekleyin, karıştırın ve her kuyucuğa 100 µL koyun.
Süspansiyon tek başına son hacimden fazlaysa stok bu yoğunluk için fazla seyreltiktir: hücreleri santrifüjle çöktürün, daha az besiyerinde yeniden süspanse edin ve yeniden sayın.
Büyüme alanları ve tipik hacimler
| Kap | Büyüme alanı | Besiyeri | Tipik ekim (HeLa) |
|---|---|---|---|
| 6 kuyucuklu plaka | 9,6 cm² | 1–3 mL | Kuyucuk başına 0,3 × 10⁶ |
| 12 kuyucuklu plaka | 3,5 cm² | 1–2 mL | Kuyucuk başına 0,1 × 10⁶ |
| 24 kuyucuklu plaka | 1,9 cm² | 0,5–1 mL | Kuyucuk başına 0,05 × 10⁶ |
| 48 kuyucuklu plaka | 1,1 cm² | 0,2–0,4 mL | Kuyucuk başına 0,03 × 10⁶ |
| 96 kuyucuklu plaka | 0,32 cm² | 0,1–0,2 mL | Kuyucuk başına 0,01 × 10⁶ |
| 384 kuyucuklu plaka | 0,084 cm² | ~0,08 mL | Kuyucuk başına 0,0018 × 10⁶ |
| 35 / 60 / 100 mm petri kabı | 8,8 / 21,5 / 56,7 cm² | 2 / 5 / 12 mL | 0.3 / 0.8 / 2.2 × 10⁶ |
| T-25 / T-75 / T-175 flask | 25 / 75 / 175 cm² | 3–5 / 8–15 / 35–53 mL | 0.7 / 2.1 / 4.9 × 10⁶ |
Değerler, Thermo Fisher’ın hücre kültürü başvuru tablosundan (Nunc kapları) alınmıştır. Diğer markalar biraz farklıdır; örneğin bir Corning 6 kuyucuklu plakanın kuyucuğu 9,5 cm²’dir. Yukarıdaki alan değeri düzenlenebilir. Doğru yoğunluk, hücre hattına ve kültürün ne zaman konfluensiye ulaşmasını istediğinize bağlıdır; bu nedenle HeLa değerlerini bir başlangıç noktası olarak kabul edin.
Eşit ekim
- Ekimden hemen önce bir hemositometre veya otomatik sayıcıyla sayın ve canlı hücre konsantrasyonunu kullanın.
- Karışımı süspansiyon hâlinde tutun: sıralar arasında ters çevirin veya pipetleyin; çünkü hücreler birkaç dakika içinde çöker.
- Kenarlarda yığılmayı azaltmak için yeni ekilmiş plakayı inkübatöre koymadan önce oda sıcaklığında 15–30 dakika düz bir yüzeyde bekletin.
- Görüntüleme için her kuyucuktan birkaç alan görüntüleyin ve yoğunluğu görüntüler üzerinde kontrol edin: kalibre edilmiş bir görüntüde mm² başına hücre doğrudan bir sayımdan elde edilir.
Sorular
Kuyucuk başına hücre nasıl hesaplanır?
cm² başına hücre cinsinden ekim yoğunluğunu bir kuyucuğun büyüme alanıyla çarpın. 96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğu yaklaşık 0,32 cm²’dir; dolayısıyla 20.000 hücre/cm², kuyucuk başına 6.400 hücre demektir.
Ne kadar hücre süspansiyonu gerekir?
Toplam gereken hücre ÷ hücre konsantrasyonu. 1 × 10⁶ hücre/mL’den 6.400’er hücreli 96 kuyucuk (artı %10 fazla) için bu, 675.840 ÷ 1.000.000 ≈ 0,68 mL eder; ardından besiyeriyle son hacme tamamlanır.
Bu, C1V1 = C2V2 ile aynı mı?
Evet. Hesaplayıcı C1 × V1 = C2 × V2 denklemini hücreler için çözer: C1 stok konsantrasyonunuz, C2 ekim karışımının konsantrasyonu (kuyucuk başına hücre ÷ kuyucuk başına hacim), V2 toplam hacim ve V1 alınacak süspansiyondur.
96 kuyucuklu bir plakanın kuyucuğunun yüzey alanı nedir?
Standart düz tabanlı bir kuyucuk için yaklaşık 0,32 cm² (Thermo Fisher ve Corning’in ikisi de 0,32 cm² verir); yarım alanlı 96 kuyucuklu plakalarda yaklaşık 0,16 cm²’dir.
Bu hesaplayıcı ücretsiz mi?
Evet. Tarayıcınızda çalışır ve hiçbir yere bir şey göndermez. Aynı ekibin geliştirdiği masaüstü mikroskopi uygulaması SlideScope ise ücretsiz bir örnek kitaplığı (tüm araçlarla) ve kendi görüntüleriniz için abonelik sunan ücretli bir uygulamadır.
Kaynaklar
Sonuçlar kuramsal veya aritmetiktir; klinik ya da düzenlemeye tabi çalışmalarda bunlara güvenmeden önce cihazınızın belgeleriyle karşılaştırın.
Gerçek görüntüleriniz üzerinde ölçün
SlideScope, aralarında CZI, ND2, SVS ve LIF’in de bulunduğu 34 mikroskop ve slayt tarayıcı biçimini kendi kalibrasyonlarıyla açar; böylece uzunluklar, alanlar, hücre sayıları ve ölçek çubukları hiçbir ayar yapmadan µm cinsinden elde edilir. Tüm araçları yerleşik örneklerde ücretsiz deneyin; kendi görüntülerinizi açmak için abonelik gerekir. Kararınızı verdiniz mi? Hemen abone olun.